荆芥HD-Zip基因家族的全基因组鉴定及分析

周佩娜，党静洁，邵永芳，石遵睿，张 琳，刘潺潺，吴啟南,3

（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023）

中药荆芥是唇形科Labiatae植物荆芥Schizonepeta tenuifolia干燥后的地上部分，有解表祛风、透疹止血等功效[1]。荆芥的挥发油、黄酮等活性成分被广泛用于医药、食品和化工等领域[2−3]。

HD-Zip (Homeodomain-leucine zipper protein)基因家族是植物界一类特有的转录因子，在植物的生长发育、适应环境及胁迫应答等方面起到重要作用。HD (Homeodomain)蛋白是由Homeobox(HB)基因编码的高度保守的蛋白质结构域，由60个氨基酸组成。该蛋白中存在1个特征性的三螺旋结构，可以特异结合DNA序列，以此对基因进行调控[4−5]。此外，HD-Zip基因家族还有1个亮氨酸拉链保守结构域(leucine zipper-loop-zipper，LZ)，这是蛋白形成二聚体所必需的结构。根据蛋白的序列保守性、蛋白功能、基因结构等，将该家族分为4个亚家族：HD-Zip Ⅰ ～Ⅳ[6]。Ⅰ亚家族主要参与非生物胁迫及环境适应性；Ⅱ亚家族主要与生长素响应相关；Ⅲ亚家族主要参与不同的发育事件，例如顶端分生组织、维管束的发育，还与植物激素调控相关；Ⅳ亚家族主要在植物的表皮中特异性表达，主要调节表皮的分化、毛状体形成等[7]。

目前，HD-Zip基因家族在多种植物中被鉴定并表征，例如拟南芥Arabidopsis thaliana[8]、水稻Oryza sativa[9]、小麦Triticum aestivum[10]等，但尚未有荆芥HD-Zip基因家族的相关研究。本研究以荆芥的基因组作为基础，利用生物信息学方法系统鉴定荆芥HD-Zip基因家族成员，并对其蛋白质理化性质、染色体定位、基因结构、共线性分析以及不同时期的表达规律进行分析，为今后深入研究荆芥基因家族的功能和调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 荆芥 HD-Zip 基因家族序列的获得

基于已知的HD-Zip基因家族的保守结构域，在荆芥基因组数据中进行初步筛选，利用TBtools(v1.98741)的“Blast Compare Two Seqs”，下载的蛋白序列为 Query Seq，荆芥基因组的蛋白序列为Subject Seq，设置E-value为10−10进行比对[11]。根据HD-Zip基因家族在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的比对结果，得到目的基因编码蛋白的保守结构域，使用“Visualize NCBI CDD Domain Pattern”进行保守结构域的可视化。利用在线网站ExPASy (https://www.expasy.org/)对蛋白序列的基本理化性质，如氨基酸数目、等电点和分子质量等进行预测。

1.2 系统进化树构建

在NCBI在线网站上下载已被表征的HD-Zip基因家族的蛋白序列。将经过筛选的荆芥HD-Zip蛋白序列与下载的蛋白序列利用MEGA X进行最大似然 (ML)进化树的构建。选择最优氨基酸替代模型，根据氨基酸模型结果构建ML树，设置bootstrap为1 000，partial deletion为80%。利用在线网站iTOL(https://itol.embl.de/#)对进化树进行美化。

1.3 基因结构和 motif分析

在荆芥基因组中搜索HD-Zip基因在染色体上的具体位置和每条染色体的总长度，利用TBtools中的“Visualize Gene Structure (Basic)”功能，对筛选的基因ID进行基因结构的可视化。利用在线网站MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)对筛选的荆芥HD-Zip基因编码的蛋白序列进行蛋白保守基序预测，设置基序数量为 10 个，选择“Zero or One Occurence Per Sequence (zoops)”分布基序。采用TBtools中的“Visualize MEME/MSAT Motif Pattern”进行保守基序的可视化处理。

1.4 染色体定位、顺式作用元件及共线性分析

利用TBtools的“Gene Location Visualize from GTF/GFF”进行基因在染色体分布的可视化。将筛选的基因序列利用 TBtools中的“Gene Location Visualize fron GTF/GFF”功能进行染色体定位分析；提取荆芥 HD-Zip基因序列的启动子部分 (5′UTR上游 2 000 bp)，利用 PlantCARE在线网站 (http://bioin formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测顺式元件并整理结果，再利用TBtools中的“Gene Structure View (Advanced)”对其进行可视化处理。使用MCScanX软件进行基因组内荆芥HD-Zip基因的共线性分析以及与拟南芥基因组间的共线性分析，并利用Circos软件绘制基因组内和基因组之间的共线性图谱。

1.5 荆芥 HD-Zip 基因家族的表达模式分析

根据HD-Zip基因ID于不同时期荆芥叶片(10、20、35 d)及根(35 d)的转录组数据中进行搜索，得到基因的 FPKM (fragments per kilobase per million)值，利用 TBtools的“HeatMap”绘制基因表达热图，探究HD-Zip基因家族的表达模式。

2 结果与分析

2.1 荆芥 HD-Zip 基因家族鉴定

荆芥基因组大小为798 Mb，Q20(碱基被测错的概率为1%)为94.67%，Q30(碱基被测错的概率为1‰)为89.41%，说明测序质量较好(Q20≥93%、Q30≥86%)，GC含量为39.34%，经过Hi-C组装后，共有696 Mb的基因组序列被定位到6条染色体上(Chr 01～06)，占比91.38%。以上数据说明荆芥的基因组质量较好，有助于完整地挖掘HD-Zip基因家族。为了鉴定荆芥中HD-Zip基因，根据4个亚家族HDZip Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蛋白保守结构域进行筛选，共筛选到42条可能的HD-Zip基因家族序列，其中HD-Zip Ⅰ亚家族16条，HD-Zip Ⅱ亚家族7条，HD-Zip Ⅲ亚家族5条，HD-Zip Ⅳ亚家族14条，并通过在线网站Expasy网站进行蛋白分子量和等电点的预测(表1)。其中40条基因全部定位到对应染色体(Chr 01～06)，Sch000029960和Sch000004651未锚定在染色体上(图1)。荆芥HD-Zip基因仅在2～4号染色体上集中分布，说明该基因家族在染色体上分布不均匀。荆芥HD-Zip的基因长度为528～2 586 bp；分子量为20.33～94.18 kDa；等电点为4.59～9.05。因此，HD-Zip的基因和蛋白长度跨度较大，HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的基因长度约2 000 bp，HD-Zip Ⅰ和Ⅱ在1 000 bp以下，该结果与分子量具有相关性，而等电点主要取决于氨基酸中酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比，大多数蛋白(76.2%)等电点小于7.0，证明荆芥HDZip可能是一类酸性蛋白。

图1 荆芥 HD-Zip 基因家族的染色体定位Figure 1 Chromosome mapping of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

表1 荆芥 HD-Zip 基因家族的蛋白特征Table 1 Protein characteristics of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

2.2 荆芥 HD-Zip 基因家族的系统进化树分析

将以上42条蛋白序列与已知的HD-Zip蛋白序列进行ML树的构建(图2)，可知：荆芥的HD-Zip和拟南芥及其他物种HD-Zip的蛋白序列被聚为四大支，与已表征HD-Zip基因家族的4个亚家族分类一致，且在荆芥基因组中，每个亚家族基因的占比与拟南芥的HD-Zip Ⅰ ～Ⅳ之间的比例相似，其中HD-ZipⅠ与Ⅳ占比最大，HD-Zip Ⅲ占比最少。从进化树中可以发现：HD-Zip Ⅲ先与Ⅳ聚为一支，再与HD-ZipⅠ和Ⅱ聚为一支，说明HD-Zip Ⅲ可能与Ⅳ的亲缘关系更近。

图2 荆芥与拟南芥及其他物种HD-Zip基因家族的最大似然值进化树Figure 2 ML evolutionary tree of HD-Zip gene family between S.tenuifolia and A.thaliana and other species

2.3 荆芥 HD-Zip 基因结构分析

利用TBtools软件绘制荆芥HD-Zip基因结构图，分析基因内含子和外显子的分布情况。图3显示：HD-Zip Ⅰ与Ⅱ的基因长度较为相近，内含子1～3个(实线)，外显子2～4个(黄色标识)，基因结构比较简单。HD-Zip Ⅲ与Ⅳ基因长度较为接近，内含子8～17个，外显子9～17，其中HD-Zip Ⅲ的内含子和外显子的数量最多。以上基因结构和长度结果与ML进化树聚类结果较为一致。

图3 荆芥 HD-Zip 基因家族的基因结构分析Figure 3 Gene structure analysis of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

利用在线网站MEME对42条HD-Zip基因家族的蛋白序列进行保守基序(Motif)的检索，一共确认了10个不同的基序(图4)。其中，所有蛋白均存在Motif 1～3，这3个保守基序构成了HD-Zip基因家族特征的保守基序HD、LZ。HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的Motif 4、Motif 5构成HD-Zip Ⅲ和Ⅳ特有的START保守结构域。从Motif结构分布上看到，HD-ZipⅢ和Ⅳ的Motif最为丰富，可能具有多样的生物学功能，每个亚家族之间的Motif分布较为一致。

图4 荆芥 HD-Zip 基因家族的保守基序分析Figure 4 Conservative motif analysis of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

2.4 荆芥HD-Zip基因家族的顺式元件及共线性分析

提取荆芥HD-Zip的5′UTR上游的2 kb序列为启动子序列，利用在线网站PlantCARE进行顺式元件的预测，其中光响应的顺式元件出现频率最高，其次为脱落酸响应元件，MeJA响应元件，厌氧感应元件以及MYB结合的位点(图5)。说明该基因家族可能与以上的生物学功能相关。

图5 荆芥 HD-Zip 基因家族的顺式作用元件分布Figure 5 Distribution of cis-acting elements of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

对荆芥的42个HD-Zip家族基因进行基因组内串联重复分析，发现Sch000008983和Sch000006831在Chr 02上串联重复，Sch000012213与Sch000012322在Chr 03上串联重复(图6)；经过基因组内的共线性分析发现，荆芥的9个HD-Zip家族基因在基因组内存在共线性，说明成对的共线性基因可能具有极为相似的功能(图7)。通过荆芥与拟南芥的基因组之间的共线性分析发现：一共有37对共线性的HDZip基因(图8)。综上，通过与拟南芥HD-Zip基因构建进化树分析及共线性分析，有助于利用拟南芥的基因功能推断荆芥HD-Zip中相应基因的功能。

图6 荆芥 HD-Zip 基因家族的组内串联重复分析Figure 6 Tandem repeat analysis of HD-Zip gene family in genome of S.tenuifolia

图7 荆芥 HD-Zip 基因家族的组内共线性分析Figure 7 Intra-group collinearity analysis of HD-Zip gene family in S.tenuifolia

图8 荆芥 HD-Zip 与拟南芥基因组之间的共线性分析Figure 8 Collinear analysis of HD-Zip gene between S.tenuifolia and A.thaliana genomes

2.5 荆芥 HD-Zip 基因家族的表达分析

根据课题组前期观察，10 d幼苗的叶子和茎具有丰富的指状腺毛，20 d幼苗的叶子和茎具有较多的头状腺毛和腺鳞，35 d幼苗的叶子和茎具有丰富的腺鳞。因此，对荆芥不同生长时期叶片(10、20、35 d)及根(35 d)进行转录组分析，发现HD-Zip Ⅰ主要在幼叶10 d中表达，HD-ZipⅡ和Ⅲ主要在根中表达，HD-Zip Ⅳ亚家族主要在叶中表达(图9)。研究发现：HD-Zip Ⅳ基因主要调节表皮的分化[12]，结合荆芥腺毛的分布情况，推测荆芥的HD-Zip Ⅳ与荆芥腺毛和非腺毛的形成与分化相关。

图9 HD-Zip 家族基因表达模式Figure 9 HD-Zip family gene expression pattern

3 讨论

本研究从全基因组水平对荆芥的HD-Zip基因家族进行了系统的研究，共鉴定到42个HD-Zip家族的基因，根据识别的DNA序列、结构域、蛋白功能，可将这些序列分为4个亚家族，分别为HD-ZipⅠ ～Ⅳ，这与拟南芥、小麦、水稻、玉米Zea mays、土豆Solanum tuberosum、烟草Nicotiana tabacum等中的分类一致[7−9, 13−15]。HD-Zip Ⅰ只含有高保守的HD结构域和位于HD结构域羧基端的LZ结构域；HDZip Ⅱ除了HD-Zip Ⅰ具有的HD和LZ保守结构域外，还存在1个高度保守的N-末端；HD-Zip Ⅲ具有HD和LZ保守结构域，以及类固醇合成急性调节蛋白相关的脂质转运结构域(START)和氨基酸序列羧基端的MEKHLA基序，其中START结构域的长度为220个氨基酸且可以结合并转移脂质，MEKHLA基序与许多非生物胁迫应答相关[16−17]；HD-Zip Ⅳ结构与HD-Zip Ⅲ非常相似，具有HD、LZ、START结构域，但缺失了MEKHLA基序[18]。荆芥的HD-Zip Ⅰ和Ⅳ亚家族的基因所占比例最高，这与拟南芥HD-ZipⅠ和Ⅳ的比例相似。基因的进化树结果显示：HD-Zip Ⅰ与Ⅱ亲缘关系更近，HD-Zip Ⅲ与Ⅳ亲缘关系更近，由此可以推测以上2个分支可能是由相同的祖先进化而来，或者Ⅳ是由Ⅲ进化来，但在分化过程中丢失了MEKHLA基序[19]。结合基因的结构来看，HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的结构比HD-Zip Ⅰ与Ⅱ的结构更为复杂，以上结果说明可能HD-Zip Ⅲ与Ⅳ相比于HD-ZipⅠ和Ⅱ进化程度更高，基因结构更为复杂，以上结果与保守结构域分析和进化树的分析结果一致。这说明HD-Zip家族在物种的亚群内部较为保守，但其具体的基因功能可能会由于基因复制或者进化，以及物种间的差异性从而出现一定的差异。

分析启动子发现：在每个亚族内部的基因启动子区顺式作用元件类型基本相同，例如MYB结合位点、脱落酸响应元件以及MeJA响应元件在HD-Zip Ⅳ高频出现。同时，同一亚族基因编码蛋白的保守基序也基本相同，HD-Zip Ⅰ ～Ⅳ的表达分析发现：HD-Zip Ⅰ ～Ⅳ具有不同的表达偏好性，说明荆芥中不同HD-Zip家族不同亚家族可能具有不同的生物学功能，但同一亚族各基因的生物学功能基本相同。

有研究表明：HD-Zip Ⅳ在表皮中特异表达，参与植物表皮细胞的分化，调节毛状体(腺毛和非腺毛)等形成与发育。如烟草中的NtHDG2，拟南芥的PDF2，黄花蒿Artemisia annua的AaHD1和AaHD8，番茄Solanum lycopersicum的SlCD2和SlWo均对毛状体具有调控作用，属于HD-Zip Ⅳ[14, 20−22]。本研究中发现荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因大部分在叶片表达，推测可能这些基因与毛状体的发育相关。结合拟南芥与荆芥HD-Zip基因家族的共线性分析，可以推测荆芥HD-Zip基因家族的生物学功能。结合文献，发现Sch000029960与AT4G21750.1及AT4G04890.2为同源基因，AT4G21750.1及AT4G04890.2分别编码拟南芥的GL2-like和PDF2，与拟南芥的表皮发育密切相关。Sch000024046与AT1G79840.2为同源基因，AT1G79840.2编码GL2，在拟南芥中影响表皮细胞的特性，包括毛状体、根毛发育等[23]。在荆芥的叶、茎、花穗等多个部位表面分布着多种腺毛及非腺毛，其中，盾状腺毛即腺鳞被认为是荆芥产生挥发油的“品质载体”[24−25]，但是调控荆芥腺鳞生长发育的分子机制还未被报道，本研究中筛选的HDZip Ⅳ亚基因家族可能为腺鳞发育调控的候选基因。通过对候选基因功能的验证、共表达分析等为腺鳞生长发育分子机制的阐明提供线索，同时为提高荆芥药用品质提供理论基础。

4 结论

本研究在荆芥全基因水平上筛选到42条HD-Zip基因序列，并对以上序列的基因结构、保守基序、顺式作用元件等进行了分析。系统发育分析可将42条序列分为4个亚家族(HD-Zip Ⅰ ～Ⅳ)。通过与拟南芥基因组之间的共线性分析、表达模式分析等推测，荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因可能在毛状体发育过程中起到重要作用。这些结果为后续荆芥的HD-Zip基因家族的功能研究及表征提供了理论基础。