miR-21通过调节TGF-β/activin信号通路影响人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的机制

刘晖 李熙 吴学军 林妙阔

(厦门大学附属福州第二医院，福建 福州 350000)

骨髓间质干细胞(BMSCs)具有广义上干细胞的特征，自我增殖能力强，能够进行多向分化为成骨细胞、心肌细胞、神经细胞等〔1,2〕。在医学领域经常会有骨缺损的情况发生，骨组织工程的进步为患者的这一病症提供了良好的解决方式〔3,4〕，尤其是其中的干细胞疗法成为现阶段的新兴研究方向。微小RNA〔5〕(miRNA)是一种特属于真核细胞中的内源性的非编码RNA，长度仅仅在20个核苷酸左右，具有特异性识别靶基因3′端非翻译区的功能，在细胞的新陈代谢等病理生理中起着不可或缺的调控作用〔6,7〕。而miR-21也与多种生物学过程密切相关，具有调控细胞新陈代谢、血管再生、成骨分化等作用〔8,9〕。转化生长因子(TGF)-β是一种具有多种功能的细胞因子，主要调控细胞的生长，在成骨细胞的分化中也具有重要作用〔10〕。本研究以TGF-β/激活蛋白(activin)信号通路为基础，探讨miR-21对BMSCs分化为成骨细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂 胎牛血清(货号10270-106，上海昱都生物科技有限公司)，低糖型DMEM培养基、Li-pofectamineTM2000(Thermo Fisher)，miR-21模拟物(mimics)、miR-21抑制剂(inhibitor)由诺扬生物技术公司合成，青霉素、链霉素(货号BJ016251、BJ016332，上海邦景实业有限公司)，pmirGLO载体(货号LM1439，上海联迈生物工程有限公司)、双荧光素酶报告基因试剂盒(货号ab228530，英国Abcam公司)，MTT检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(货号11465007001、23225、10503027、18091050，美国Sigma公司)，引物由上海江林生物科技有限公司提供。

1.2细胞

1.2.1BMSCs的分离及培养 骨髓由健康献髓者捐赠，使用L-DMEM对采集的抗凝骨髓按照1∶5的比例稀释，然后使用Percoll分离液对其进行分离。具体步骤：首先在试管底部加入1.073 g/ml的Percoll分离液，然后将处理后的骨髓通过1∶1的比例缓慢滴加进试管，以2 800 r/min的条件对其离心30 min，得到的单个核细胞使用L-DMEM洗涤两次后在含有10%胎牛血清的L-DMEM培养基中进行培养，培养时使用24孔板，规定浓度为2.0×105/cm2，放置于37℃，含有5%CO2的培养箱中，2 d后将非贴壁细胞清除，其余细胞置于新鲜的培养基中，在细胞扩增到瓶底的90%融合时，使用0.05%的胰蛋白酶分解，并按照1∶1的比例对其进行传代，传代至2代以1∶2的比例进行传代培养。

1.2.2转染及分组 将培养的BMSCs细胞分为无转染的空白对照组，转染miR-21 mimics的BMSCs组、转染有miR-21 inhibitor的miR-21敲低组。将生长程度为70%～80%融合度的细胞接种到细胞瓶中，再使用Li-pofectamineTM2000并按照其说明书来进行转染，这样进行2 d后将细胞培养液倒清，细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，后使用细胞裂解液进行细胞裂解。

1.3实验方法

1.3.1miR-21靶基因预测 联合TargetScan和miRanda两个网站对miR-21的靶基因进行探找，最终选择TGF-β/activin信号通路上miR-21的靶基因：TGF-β受体Ⅱ(TGF-βR2)、TGF-β1(activin)。

1.3.2RT-PCR检测相关基因 通过Trizol法对总RNA进行提取，具体的操作按照说明书进行，然后将其进行纯化定量，再按照逆转录试剂盒中的说明书步骤合成互补DNA，在RT-PCR试剂盒的步骤要求下对miR-21、TGF-βR2、TGFβ1、骨特异性转录因子(Runx)2、成骨细胞特异基因(Osterix)mRNA的表达情况进行检测，以U6和GAPDH作为内参，使用2-△△Ct公式对它的表达情况进行分析。

1.3.3Western印迹检测相关蛋白 使用裂解液裂解细胞，将裂解的细胞置于EP管中进行离心，离心条件为：12 000 r/min，4℃，15 min，然后收集上清液，根据BCA法检测TGF-βR2、TGF-β1、Runx2、Osterix蛋白表达，从而可以通过BandScan5.0对得到的目的蛋白条带进行分析。

1.3.4成骨细胞的鉴定

1.3.4.1钙沉积检测 细胞经miR-21过表达或敲低后21 d后使用PBS洗涤两次后加入适当的茜素红S染液进行滴染，维持3～5 min，于显微镜下对染色结果进行观察。

1.3.4.2碱性磷酸酶(ALP)活性测定 按照ALP测定试剂盒的步骤，于细胞转染miR-21后的第0、3、6、9、12、15、18、21天对其ALP活性进行检测。

1.3.4.3骨桥蛋白(OPN)检测 合成cDNA后对PCR进行扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测后通过EB得出显色结果。

1.4统计学分析 利用SPSS24.0进行单因素方差分析，多组内采用LSD-t两两比较，Pearson分析相关性。

2 结 果

2.1miR-21转染对TGF-β1及TGF-βR2的影响 如表1所示，与空白对照组相比， miR-21过表达组中TGF-β1与TGF-βR2 mRNA的表达均显著上升(P<0.05)，而miR-21敲低组中TGF-β1与TGF-βR2 mRNA的表达显著降低(P<0.05)。miR-21与TGF-β1、TGF-βR2均呈正相关(r=0.568，P<0.05；r=0.627，P<0.05)。

2.2过表达miR-21可能增强TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表达 如图1、表2所示，与对照组相比，miR-21过表达组TGF-β1与TGF-βR2蛋白的表达明显上升(P<0.05)，miR-21敲低组TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

表1 miR-21转染后miR-21、TGF-β1及TGF-βR2 mRNA的表达

图1 TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表达情况

表2 miR-21转染后 TGF-β1、TGF-βR2的蛋白水平

2.3成骨细胞的鉴定结果

2.3.1钙沉积检测 如图2所示，miR-21过表达组转染21 d后染色通过显微镜观察可见染液与钙盐结合后成的橘色物质，已形成钙沉淀。

图2 成骨细胞的钙沉淀(茜素红S染色，×200)

2.3.2ALP活性检测结果 与空白对照组及miR-21敲低组相比，miR-21过表达组15 d、21 d ALP活性增高较明显(P<0.05)。见表2。提示过表达miR-21可能能够促进BMSCs向成骨细胞分化。

2.3.3OPN检测 如图3所示，将所获取的PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行测定，可以发现，其产物扩增后约为320 bp。

M：标准marker；1、2：空白对照组；3、4：过表达miR-21组；5、6：敲低miR-21组图3 OPN的琼脂糖凝胶电泳检测

2.4成骨细胞相关基因及蛋白的表达 如表3、表4及图4所示，miR-21过表达组中Rumx2与Osterix基因及蛋白的表达较空白对照组显著上升(P<0.05)，而miR-21敲低组中成骨细胞Rumx2与Osterix基因及蛋白的表达较空白对照组和miR-21过表达组显著降低(P<0.05)。miR-21与成骨细胞相关基因Rumx2、Osterix均呈正相关(r=0.627，P<0.05；r=0.516，P<0.05)。

表3 成骨细胞相关基因Rumx2与Osterix mRNA的表达

表4 miR-21转染后Runx2、Osterix的蛋白水平

图4 各组Rumx2及Osterix蛋白表达

3 讨 论

对于骨科疾病的研究从古代时期便开始，从使用针灸、中医手法复位，到中西医结合治疗等〔11〕，而对于一些类似于骨损伤，骨软骨缺损，或者一些由恶性肿瘤细胞引起的异常骨样来说〔12〕，还是需要利用好现代的生物力学及微观发展思路〔13〕。BMSCs是一种多能干细胞，能够分化为多种成熟细胞，例如成骨细胞、脂肪细胞等，除此之外，还具有分离、体外扩增、免疫等功能，并且在血管的生成及组织修复方面还具有极其重要的治疗潜能〔14,15〕。

近年来有不少针对成骨细胞分化的研究，有研究表明miRNA作为一种关键的转录后调控RNA，在成骨细胞分化方面承担着至关重要的调控角色〔16〕，并且已有多项研究发现，属于miRNA超家族的部分成员在BMSCs向成骨细胞分化的这一进程中具有重要的作用，比如Zhang等〔17〕在了解到人脂肪来源的干细胞可以作为骨再生中的种子细胞来源后，提出如何改善骨组织工程中脂肪间充质干细胞(hASCs)成骨分化，及各种因子是如何调节这一分化的问题，他们通过实时PCR对miR-218的表达进行检测，结果显示在成骨分化的这个过程中miR-218出现了表达上调的情况，并且miR-218能够直接靶向分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2和Dickkopf相关蛋白(DKK)2，它的过表达可以提高Wnt/β-连环蛋白信号传导的活性，使成骨细胞更快的分化；杨楠等〔18〕，针对骨质疏松患者特有的骨吸收能力加快、骨形成能力下降这一问题为导向，来探究骨形成能力与骨分化能力的关系，研究发现绝经后骨质疏松患者成骨能力会有所减弱，而通过miR-21对细胞转染，降低软脂酰化磷蛋白(Spry1)的表达可恢复成骨分化水平。miR-21最早在人脑瘤中发现，现今在发育、干细胞生物学等众多领域均有所涉及，尤其在肿瘤的发展中应用较多〔19〕，对细胞的增殖凋亡能够起到调控作用。TGF-β是一种具有多种功能的生长因子，能够影响不同种类型的细胞，具有调控细胞生长分化、迁移、凋亡等效用〔20〕，其家族成员包括TGF-β、activin、骨形态发育蛋白(BMP)等，其各自介导的信号通路具有不同的作用〔21〕。

本文结果提示过表达miR-21可以使其靶基因TGF-β1、TGF-βR2的表达上调。过表达miR-21可能促进BMSCs分化为成骨细胞。

综上所述，miR-21能够促进BMSCs分化为成骨细胞，其机制可能是通过上调TGF-β/activin信号通路中TGF-β1、TGF-βR2的表达来促进其分化。