TP63对非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性及DSC3/DSG3基因表达的影响

杨颖 成薇婷 何肇晴 汪锐 李婧

(武汉市第一医院肿瘤科一病区，湖北 武汉 430022)

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于其恶性程度高，预后差，5年生存率约15%，其中肺腺癌为最主要的病理类型。吉非替尼为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，常用于NSCLC患者的治疗，可提高患者生存率，然而多数患者在治疗一段时间(9.2～14.7个月)后会产生耐药性〔1,2〕。因此，探究NSCLC的耐药机制，有助于提高癌细胞对吉非替尼的敏感性，对改善患者预后具有重要意义。肿瘤蛋白(TP)63是p53的同源基因，可参与调控干细胞的分化、组织的生长发育及肿瘤的发生等，在表皮发育与衰老中起重要作用〔3〕。有研究表明，TP63不仅参与肿瘤细胞的增殖、分化，TP63的异常表达也与肿瘤细胞的耐药性有关〔4〕。但TP63是否参与NSCLC对吉非替尼耐药性尚不清楚。桥粒芯胶蛋白(DSC)3是参与细胞间桥连接的钙结合膜糖蛋白，可介导细胞黏附作用，在NSCLC等多种肿瘤中均有表达〔5〕。桥粒芯糖蛋白(DSG)3属于黏附分子中的钙黏素超家族的成员，在NSCLC中表达水平升高，在肺鳞癌中阳性表达高于肺腺癌，可作为区分肺鳞癌与肺腺癌的标志物〔6〕。本研究探索TP63对人NSCLC细胞(PC9)吉非替尼耐药及DSC3/DSG3表达的影响，以期为临床探索克服NSCLC对吉非替尼耐药性的有效方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要材料与仪器 人NSCLC吉非替尼敏感细胞株PC9、吉非替尼耐药株PC9/GR购于中国科学院细胞库；吉非替尼购于美国Selleckchem公司；TP63干扰RNA序列购于苏州吉玛基因公司；TP63、DSG3、DSC3 及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成；PCR试剂盒、反转录试剂盒购自日本Takara公司；Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自杭州四季青生物科技公司；CCK-8试剂盒、膜联蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；兔抗人TP63、DSG3、DSC3、β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 将PC9与PC9/GR细胞接种于DMEM培养基中进行培养，待细胞融合至80%左右时，进行后续试验。取耐药细胞 PC9/GR消化接种于24孔板中，调整细胞浓度为5×106个/ml，每孔接种200 μl，实验分为对照组、TP63-siRNA组和NC-siRNA，对照组不做转染，其余两组分别转染TP63干扰RNA(TP63-siRNA)和阴性对照(NC-siRNA)，按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将TP63-siRNA和NC-siRNA转染PC9/GR细胞，转染48 h后，进行阳性克隆筛选。

1.2.2TP63-siRNA转染后 PC9/GR细胞对吉非替尼的半数抑制浓度 收集对照组、TP63-siRNA和NC-siRNA组对数生长期PC9/GR细胞，调整细胞浓度为5×106/ml，按照每孔200 μl接种至96孔板中，分别加入吉非替尼使其终浓度为0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，同时设置二甲基亚砜(DMSO)对照孔，培养48 h后，每孔加入CCK-8液，孵育30 min后，测定450 nm处吸光度值，计算各组细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验检测TP63、DSG3、DSC3 mRNA表达 采用qRT-PCR检测PC9与各组细胞中TP63、DSG3、DSC3相对表达量，使用RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法分别计算各RNA相对表达量。引物序列：TP63上游引物5′-3′：GGACCAGCAGATTCAGAACGG；下游5′-3′：AGG ACA CGTCGAAACTGTGCDSG3上游引物5′-3′：GGAGGAACAGACTAACAGGC；下游5′-3′：ACCATCAGGAGGGCCAGAGADSC3上游引物5′-3′：GAAAGTAGTAG ACCTGGTACT；下游5′-3′：ACGCCTGTGCTGGGATGCAGAPDH上游引物5′-3′：GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG；下游5′-3′：TGTGCCGTTGAATTTGCCGTGAGTGG。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖 取对照组、TP63-siRNA组和NC-siRNA细胞，调整细胞浓度为5×106/ml，按照每孔200 μl接种至96孔板中，分别于24、48、72 h时向每孔加入100 μl浓度为10%的CCK8的反应液，于450 nm酶标仪测定吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.5细胞凋亡实验 取对照组、TP63-siRNA组和NC-siRNA细胞，调整细胞浓度为5×106/ml，按照每孔200 μl接种至96孔板中，培养24 h后，分别加入5 μl Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)和5 μl PI染液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6划痕实验检测细胞迁移能力 取对照组、TP63-siRNA组和NC-siRNA组对数生长期细胞，接种于6孔板中，用无血清的培养基调整细胞密度，使每孔接种约2×105个细胞，培养24后，用200 μl的枪头在各孔垂直划痕，培养48 h后，显微镜观察拍照，测量划痕距离，计算愈合率。愈合率(%)=〔(愈合前划痕两侧细胞间距离-愈合后划痕两侧细胞间距离)/愈合前划痕两侧细胞间距离〕×100%

1.2.7Transwell 小室检测细胞侵袭 将融化的基质胶铺于24孔Transwell板上室中，待基质胶凝固，取对照组、TP63-siRNA组和NC-siRNA组对数生长期细胞，用无血清培养液调整细胞密度，每孔接种3×105个细胞，下室加入10%胎牛血清(FBS)的完全培养基，培养24 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色10 min，显微镜观察拍照，并计算穿模细胞数。

1.2.8Western印迹检测TP63、DSG3、DSC3蛋白表达 取PC9与各组细胞接种于6孔板中，培养48 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，加入裂解液提取总蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后转膜，使用10%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人TP63、DSG3、DSC3单克隆抗体和β-actin，37℃孵育2 h后，TBST洗涤3次，再加入相应的二抗，室温孵育1 h，使用电化学发光(ECL)试剂显色，以β-actin为内参，分析各条带灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1PC9细胞和PC9/GR细胞中TP63的表达 与PC9细胞相比，耐药细胞PC9/GR中TP63 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图1，表1。

图1 Western印迹检测TP63蛋白表达

表1 PC9、 PC9/GR细胞TP63表达

2.2干扰TP63的表达对PC9/GR细胞IC50值的影响 与对照组和NC-siRNA组相比，TP63-siRNA组 PC9/GR细胞IC50值显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3干扰TP63的表达对PC9/GR细胞增殖与凋亡的影响 与对照组和NC-siRNA组比较，TP63-siRNA组PC9/GR细胞48、72 h增殖显著下降，凋亡率显著升高(P<0.05)；说明干扰TP63的表达显著抑制PC9/GR细胞增殖，促进细胞凋亡。见表2、表3、图2。

2.4干扰TP63的表达对PC9/GR细胞迁移、侵袭的影响 与对照组和NC-siRNA组比较，TP63-siRNA组 PC9/GR细胞迁移、侵袭能力显著下降(P<0.05)；说明干扰TP63的表达可显著抑制 PC9/GR细胞迁移、侵袭行为。见表2、图3、4。

2.5干扰TP63的表达对PC9/GR细胞TP63、DSC3、DSG3 mRNA的影响 与对照组和NC-siRNA组比较，TP63-siRNA组TP63、DSC3、DSG3 mRNA表达显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组细胞IC50细胞凋亡率、迁移、侵袭及TP63、DSC3、DSG3 mRNA比较

表3 干扰TP63的表达对PC9/GR细胞增殖影响

图2 流式细胞仪检测各组PC9/GR细胞凋亡

图3 各组PC9/GR细胞迁移(×100)

图4 各组PC9/GR细胞侵袭(结晶紫染色，×200)

2.6干扰TP63的表达对PC9/GR细胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表达的影响 与对照组和NC-siRNA组比较，TP63-siRNA组TP63、DSC3、DSG3 蛋白表达显著降低(P<0.05)，见图5、表4。

1～3:对照组、NC-siRNA组、TP63-siRNA组图5 Western印迹检测各组TP63、DSC3、DSG3蛋白表达

表4 各组细胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表达情况

3 讨 论

NSCLC由于潜伏期长，患者确诊时多为中晚期，放化疗是其主要治疗方式，吉非替尼是常用于治疗NSCLC的分子靶向药物，然而EGFR基因突变会导致NSCLC吉非替尼耐药，欧美有10%～15%肺腺癌患者发生突变，而在亚洲EGFR突变可高达40%～50%，药物耐受成为EGFR-TKI治疗的瓶颈，也是导致NSCLC化疗失败的主要原因〔7,8〕。

TP63是p53家族成员的核转录因子，与p53具有同源性，在食管鳞癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤中均有表达，发挥抑癌或促癌作用〔9,10〕。TP63基因可编码TAp63、ΔNp63等两大类型蛋白，其中TAp63与p53的功能类似，可与p53的DNA结合位点相结合，诱导细胞凋亡，发挥抑癌作用；ΔNp63可竞争性结合TAp63的结合位点，降低p53的转录活性，进一步抑制细胞凋亡而促进肿瘤的发生发展〔11,12〕。郑雪等〔13〕研究表明，宫颈癌中TP63 基因启动子 DNA 甲基化抑制其表达，且与肿瘤大小、病理分级、临床分期相关。研究表明〔14〕，TP63在NSCLC表达水平升高，且肺鳞癌中TP63蛋白阳性表达率显著高于肺腺癌。本研究结果提示TP63与PC9细胞耐药有关，推测TP63可能在PC9/GR中发挥ΔNp63的促癌特性。Patel等〔4〕研究表明，在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂耐药的黑色素瘤细胞中TP63表达上调，通过用鼠双微基因(MDM)2抑制剂Nutlin-3A的治疗可降低TP63表达，促进细胞凋亡、克服耐药性。本研究结果表明干扰TP63表达，可增加PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性，TP63可能是PC9细胞吉非替尼耐药的标志物，然而其具体作用机制尚不清楚。

DSC3和DSG3都属于钙黏蛋白基因超家族，主要在细胞膜表面发挥作用，与细胞黏附、表皮细胞的定位有关。研究表明〔15〕，DSC3在前列腺癌组织与细胞系中中低表达或甲基化，且与患者预后不良有关。另外，DSC3的表达受P53途径的调节，其甲基化与结肠癌患者预后有关〔16〕。Dong等〔17〕研究表明，DSG3在NSCLC中高表达，且肺鳞癌患者DSG3相对表达水平高于肺腺癌患者，其高表达与肺鳞癌患者不良预后有关。另有研究表明〔18〕，直肠腺癌中DSG3表达水平升高，且与患者预后有关。本研究结果提示干扰TP63表达，可下调细胞DSC3、DSG3表达。DSG3可通过DSG3-plakoglobin-TCF/LEF 通路促进头颈癌细胞的生长与侵袭，沉默DSG3表达可抑制细胞生长，使细胞停留在G0/G1期〔19〕，表明下调DSG3表达可抑制癌细胞增殖，因此，本研究推测，干扰TP63表达水平可显著降低PC9/GR细胞增殖、迁移、侵袭行为可能与下调DSC3和DSG3表达有关。

综上，TP63在PC9/GR细胞中高表达，干扰TP63表达可抑制 PC9/GR 细胞增殖、迁移与侵袭行为，促进细胞凋亡，逆转PC9/GR对吉非替尼的耐药性，可能与下调DSC3/DSG3表达有关。然而，其具体作用机制仍需要做进一步研究来验证。