基于Th细胞失衡探讨酸枣仁汤对失眠小鼠认知能力的影响

吕晴 刘香杰 李俊莹 蒋国举 谷雨霏 杨晓彤 戴馨乐 翟靖 王怡欣 刘东云 冯卓航 郑璐璐 赵祎 杜盼盼 张兰宁 张玉娇 李晓冰

(河南中医药大学，河南 郑州 450008)

失眠又称入睡和维持睡眠障碍，是指无法入睡或无法保持睡眠状态，导致睡眠不足，表现为各种原因引起入睡困难、睡眠深度或频度过短、早醒及睡眠时间不足或睡眠质量差等，是一种常见病。随着失眠程度的加重，失眠患者注意力、记忆力、学习能力等认知功能下降〔1〕。目前常用于治疗失眠的药物有地西泮、阿普唑仑、三唑仑、佐匹克隆、水合氯醛等，这些西药都有一定的不良反应，包括头晕、嗜睡、乏力等“宿醉”现象，且部分药物会导致口苦、口干、恶心、呕吐、肌无力等症状。另外，长期用药易产生耐受性、成瘾性和戒断症状。相较于现代医学，中医学对本病的治疗有着独特优势。酸枣仁汤为治疗失眠的经典名方，副作用小，对失眠疗效确切〔2〕。既往对酸枣仁汤治疗失眠研究多从神经递质角度论证。炎症状态在失眠发生中起重要作用，但是目前相关研究较少。本研究探讨酸枣仁汤对失眠模型小鼠白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-10水平的影响。

1 材料与仪器

1.1动物 SPF级昆明小鼠40只，6～8周龄，体质量18～22 g，由郑州大学动物实验中心提供〔产品许可证：SCXK(豫)2019-0002〕。

1.2实验药品及制备 酸枣仁汤：炒酸枣仁，甘草，川芎，知母、茯苓中药饮片，购于河南张仲景大药房；对氯苯丙氨酸(PCPA)：美国Sigma公司，批号：1002094970；小鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-10测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3实验仪器 全自动酶标仪(美国Bio-tek公司)，电热恒温培养箱(广州市康恒仪器有限公司)，高速离心机(贝克曼库尔特公司)，电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1分组与给药 昆明种小鼠40只，随机分为5组，分别为正常组、模型组、地西泮组、酸枣仁汤低(SZR-L)、高剂量(SZR-H)组，每组8只。实验前适应性饲养1 w，实验第4天地西泮组(0.92 mg/kg)及中药高(4.8 g/kg)、低剂量(2.4 g/kg)组分别灌胃治疗，1次/d，正常组及模型组给予相同剂量生理盐水灌胃，给药10 d。

1.4.2模型制备 除正常组外，其余各组小鼠每日腹腔注射PCPA混悬液300 mg/kg，连续3 d。观察小鼠的行为学变化，选取昼夜节律消失，对外界的声、光等刺激敏感，攻击性增加，警惕性高，整体观察与正常组有明显不同的小鼠作为失眠鼠纳入实验。

1.5观察指标

1.5.1旷场实验 旷场箱(50 cm×50 cm×40 cm，周壁颜色为黑色，底面平均分为25个10 cm×10 cm小方格)正上方架摄像头，视野覆盖整个旷场。将小鼠放置在正中央格(实验前，小鼠适应1 min)，同时进行摄像和计时，时间为3 min。观察并记录小鼠总运动距离、总站立次数、中心区域运动时间。

1.5.2Morris水迷宫实验 Morris水迷宫水池直径120 cm，高度为50 cm；平台直径6 cm，高度为30 cm，表面粗糙。水池划分为东西南北4个象限(东北NE，东南SE，西南SW，西北NW)，象限池壁圆弧中点为可选的动物入水点，平台可放在任意一个象限内。进行水迷宫训练，实验前将小鼠置于站台上，适应10 s，随后将小鼠NE、NW象限分别面壁置入池内，小鼠登上站台5 s后终止记录，若小鼠在60 s内不能上台，引导其登上站台适应10 s，最后将小鼠擦干，放入鼠笼，如此将小鼠置入游泳池，每天2次，每次间隔1 h，定位航行训练需要3 d，定位航行训练后进行空间探查实验，记录小鼠平台探索总时间、平台探索总距离、目标象限探索时间、穿越平台次数(60 s)，以评判小鼠的空间记忆能力。

1.5.3酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平 采用ELISA检测血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1酸枣仁汤对失眠小鼠旷场实验影响 与正常组相比，模型组总运动距离、总站立次数明显增加，中心区域运动时间明显减少(P<0.01)；与模型组相比，SZR-L、SZR-H、地西泮组总运动距离、总站立次数降低(P<0.05，P<0.01)；中心区域运动时间延长(P<0.01,P<0.05)。见表1。

2.2酸枣仁汤对失眠小鼠水迷宫实验影响 与正常组相比，模型组平台探索总时间、总距离明显增加(P<0.01)；目标象限(四象限)探索时间百分比，穿越平台次数明显降低(P<0.01)；与模型组相比，SZR-L、SZR-H组平台探索总时间显著降低(P<0.05)；目标象限探索时间百分比及穿越平台次数明显增加(P<0.01，P<0.05)。地西泮组平台探索总时间、平台探索总距离显著低于模型组(P<0.01)，穿越平台次数显著增多(P<0.01)。见表2。

2.3酸枣仁汤对失眠小鼠血清炎性因子影响 与正常组相比，模型组血清IL-1、IL-2水平明显升高，IL-4、IL-10水平明显降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，SZR-L、SZR-H、地西泮组IL-1、IL-2水平降低，IL-4及IL-10水平升高，除SZR-L组IL-4和地西泮IL-10外，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表1 酸枣仁汤对失眠模型小鼠旷场实验影响

表2 酸枣仁汤对失眠模型小鼠水迷宫实验及血清炎性因子影响

3 讨 论

目前常用的小鼠失眠造模方法有：强迫运动法造模、人为物理因素刺激法造模、腹腔注射PCPA造模等。PCPA造模法是现阶段公认的失眠模型。PCPA通过选择作用有效抑制色氨酸羟化酶活性，导致5-羟色胺(HT)的合成减少，睡眠昼夜节律消失，几乎达到完全失眠，且不会对神经元造成实质性损害，待注射剂量全部代谢后，可逐步恢复正常〔3〕。故本实验选取腹腔注射PCPA法造模。

旷场实验是常用的动物行为学评价实验，可检测小鼠自发活动行为和探索行为，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度实验方法。旷场实验中，运动距离反映小鼠的活动度和兴奋性，站立次数、中心区域运动时间反映小鼠对陌生环境的好奇程度和探索趋势〔4〕。Morris水迷宫是20世纪80年代由英国生理学家Morris设计并应用于评估啮齿类动物学习记忆功能的重要工具，现已广泛应用于认知功能研究〔5〕。本研究结果提示酸枣仁汤可有效延缓失眠小鼠认知功能障碍进程，改善其学习能力及记忆能力。

研究发现长期慢性炎症与认知功能减退关系密切〔6〕。另有研究表明，失眠患者Th1/Th2亚群平衡失衡〔7〕。既往研究表明，免疫系统与睡眠存在双向联系，而炎性因子是这种双向作用中至关重要的介质〔8〕。Th1细胞对初始CD4+T细胞具有一定刺激作用，产生大量肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1、IL-2等炎性因子〔9〕。睡眠不足可激活小胶质细胞使IL-1β(促炎因子)表达增加，直接引起炎症反应，导致细胞凋亡与免疫损伤〔10〕。IL-2具有加快炎症细胞增殖的作用，可导致更多炎性介质的释放，破坏体内细胞因子稳态，干扰睡眠节律，从而导致失眠。睡眠质量越差，促炎介质分泌越多〔11〕。Th2细胞通过转录激活因子6及信号转导，分泌IL-4、IL-6、IL-10等炎性因子〔9〕。IL-4具有抗炎效应，可与具有促炎效应的细胞因子发生拮抗作用。IL-10具有很强的抗炎及免疫抑制活性，能减少炎性介质及其受体表达，抑制炎性细胞的增殖和迁移，对急慢性炎症均有一定抑制作用〔12〕。本实验结果提示酸枣仁汤可能通过调控Th1/Th2细胞平衡改善失眠小鼠认知功能。