响应面法优化五味子蜂蜜酒发酵工艺

郭楠楠，王 璇，李 晓，谢 立

（郑州科技学院 食品科学与工程学院 郑州市食品安全快速检测重点实验室，河南 郑州 450064）

蜂蜜营养价值极高，是一种高碳水化合物的食物，其主要成分是果糖、葡萄糖以及约25种低聚糖，同时还含有少量蛋白质、酶、氨基酸、矿物质、微量元素、维生素、芳香化合物和多酚[1]。我国蜂蜜产量位居世界第一[2]，但由于蜂蜜品质低，缺少知名品牌，导致我国蜂蜜出口价格低[3]。开发蜂蜜产品，提升蜂蜜附加值，为人民群众创产增收，稳固脱贫攻坚成果有着十分重要深远的意义[4]。蜂蜜酒是蜂蜜加水稀释经发酵制成，蜂蜜酒中含17种氨基酸和葡萄糖、果糖、维生素A（vitaminA，VA）、VE以及矿物质等，对人体有一定的保健作用[5]。董彩文等[6]以干桂花、蜂蜜为主要原料，制备干桂花蜂蜜酒，其最优发酵工艺条件为糖度28%、酵母接种量0.2%、铵盐质量浓度0.9 g/L、麦曲添加量9%，在28 ℃发酵6 d。在此发酵条件下，干桂花蜂蜜酒酒精度为16.98%vol。张杰等[7]以黑米、蜂蜜和水为原料，通过单因素试验和响应面法优化蜂蜜酒的发酵工艺，制得一款酒精度为12.7%vol的蜂蜜酒，酒体协调，呈酒红色，兼有黑米和蜂蜜特殊风味。

五味子（Schisandra chinensis）是我国著名的传统中药材，其果实具有甘、苦、辛、咸和酸五种味道[8]，五味子含有木脂素类、挥发油类等多种化学成分[9]，具有抗炎、护肝保肝功效，可用于咳嗽虚喘、神经和精神疾病、遗精、尿频、久泻不止等症状[10-11]，郑春英等[12]利用酿酒酵母发酵北五味子，发酵后的北五味子中4种主要木脂素类成分（五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲）的含量均显著提高。目前，国内已有五味子酿酒的研究报道，刘洋[13]以北五味子、大米为原料，甜酒曲为糖化发酵剂经混合发酵工艺酿制北五味子米酒，并对其发酵工艺条件进行优化。荣军等[14]以6种不同酿酒酵母发酵制备北五味子酒，发现不同酵母发酵之后的五味子酒的挥发性成分差异较大，这为五味子酒的酿酒酵母的选择提供了一定的理论参考。五味子酿酒的历史由来已久，但将其与蜂蜜复配用于酿造蜂蜜酒的研究较少，二者搭配制作的五味子蜂蜜酒可以兼具五味子功效和蜂蜜酒的营养价值。

本研究以五味子和蜂蜜为主要原料制备五味子蜂蜜酒，通过单因素试验及响应面法优化五味子蜂蜜酒的酿造工艺，并对五味子蜂蜜酒的挥发性风味成分及理化指标进行测定。以期为蜂蜜酒的研究发展提供一定的理论依据，同时将五味子应用于蜂蜜酒的酿造，以期能丰富五味子蜂蜜酒中特殊功能性成分的研究，为后续研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

北五味子干果：产自吉林长白山；多花蜂蜜：北京百花蜂业科技发展股份公司；EXCELLENCETME2F酵母：法国LAMOTHE-ABIET公司。

1.1.2 试剂

柠檬酸（食品级）：河南得立富食品配料有限公司；碳酸钠（食品级）：扶沟县味思美食品厂；膨润土：法国OENOFRANCE公司；氢氧化钠（分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；浓盐酸（分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉汤培养基、煌绿乳糖胆盐（brilliant green lactose bile，BGLB）肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

TRACE1300-TSQ9000气相色谱-质谱/质谱（gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，GC-MS/MS）联用仪：赛默飞世尔科技有限公司；ES1200-4电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；PHB-05便携式pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DZKW电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；GRP-9080型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；酒精计：河北省武强滏阳玻璃仪表厂；手持糖度计：北京云华科仪科技有限公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子蜂蜜酒的加工工艺流程及操作要点

操作要点：

五味子预处理：选择无腐烂、无霉变的五味子干果、洗净晾干，将五味子粉碎成粗颗粒之后过60目筛，便于五味子甲素等有效成分的浸出[15]，然后加水调整五味子含量为1.9%，配置成五味子水溶液。

调整成分：使用蜂蜜调整五味子水溶液的糖度为25%，柠檬酸、碳酸钠调整五味子蜂蜜混合液的pH值为4.0。

热处理：在90 ℃条件下保持30 min杀菌，此外，使蜂蜜中转化酶失活以提高发酵效率[16]。

接种、发酵：将活性干酵母于经热处理之后的发酵液5 mL中溶解，在30 ℃下保温活化20～30 min，然后接种到五味子蜂蜜混合液中，接种量为0.16%。发酵温度控制在26 ℃，发酵期间每天固定时间段测定可溶性固形物含量。当可溶性固形物含量减少缓慢时，即停止发酵。

陈酿：将发酵液置于室温条件下陈酿10 d。

澄清：提前将膨润土溶于10倍质量热水（50 ℃左右）中，静置膨化4 h。酒液中用量为1 g/L，摇匀，静置澄清5 d[17]，用杀菌后的多层纱布过滤取上清液。

巴氏杀菌：取澄清后的上清液，在高温灭菌锅中保持65 ℃，灭菌30 min，即得五味子蜂蜜酒成品。

1.3.2 五味子蜂蜜酒发酵工艺优化单因素试验

在参考其他文献的基础上[18-23]，固定发酵时间为7 d，设置五味子含量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，初始可溶性固形物含量分别为16%、20%、24%、28%、32%，酵母接种量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，初始pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，发酵期间每天固定时间段测定可溶性固形物含量。发酵停止，澄清灭菌后对五味子蜂蜜酒进行感官评分，并测定其酒精度。

1.3.3 五味子蜂蜜酒发酵工艺条件优化响应面试验

在单因素试验的基础上，以感官评分（Y）为响应值，五味子含量（A）、初始可溶性固形物含量（B）、酵母接种量（C）、初始pH值（D）四个因素为自变量，采用Design-Expert 13.0.1软件对五味子蜂蜜酒的发酵工艺条件进行优化。五味子蜂蜜酒发酵条件优化试验因素水平见表1。

表1 发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinensis mead

1.3.4 感官评价

采用感官综合评分法对五味子蜂蜜酒进行感官评分。根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，制定五味子蜂蜜酒感官评价标准，见表2，满分为100分，由14名经感官培训过的同学组成评定小组，对五味子蜂蜜酒的外观（20分）、香气（30分）、滋味（40分）和典型性（10分）对五味子蜂蜜酒进行感官评价。

表2 五味子蜂蜜酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of Schisandra chinensis mead

1.3.5 分析检测

可溶性固形物：采用手持糖度计测定；酒精度：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法；总糖、总酸：分别参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法、电位滴定法。总木脂素含量的测定：采用分光光度法[24]，总多糖含量的测定：采用分光光度法[25]。

香气成分采用GC-MS/MS分析。气相色谱条件：柱流量1.0 mL/min；TG-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温40 ℃保留3 min，然后以3 ℃/min的升温速度升至160 ℃保持2 min，以8 ℃/min的升温速度升至230 ℃保持5min。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；全扫描模式（扫描范围30～450 amu）。

菌落总数及大肠菌群的测定：按照GB 4789.2—2022《食品微生物学检验菌落总数测定》以及GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》。

1.3.6 数据处理

使用Microsoft office excel 2019、Origin 2021、Design-Expert 13.0.1进行数据处理、图表制作以及数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 五味子含量对五味子蜂蜜酒品质的影响

五味子含量对五味子蜂蜜酒品质的影响见图1。

图1 五味子含量对五味子蜂蜜酒品质的影响Fig.1 Effect of Schisandra chinensis contents on the quality of S.chinensis mead

由图1可知，随着五味子含量在1.0%～3.0%范围内的增加，酒精度呈现上升趋势，而可溶性固形物含量呈下降的趋势。当五味子含量在1.0%～2.0%范围内的增加时，感官评分逐渐增加；当五味子含量为2.0%时，感官评分达到最大值，为86分；当五味子含量＞2.0%时，感官评分逐渐下降。综合考虑，最适五味子含量为2.0%。

2.1.2 初始可溶性固形物含量对五味子蜂蜜酒品质的影响

初始可溶性固形物含量对五味子蜂蜜酒品质的影响见图2。

图2 初始可溶性固形物含量对五味子蜂蜜酒品质的影响Fig.2 Effect of primary soluble solids contents on the quality of S.chinensis mead

由图2可知，当初始可溶性固形物含量在16%～32%范围内增加时，可溶性固形物含量逐渐增加。当初始可溶性固形物含量在16%～24%范围内增加时，感官评分逐渐增加；当初始可溶性固形物含量为24%时，感官评分达到最高值，为83分；当初始可溶性固形物含量＞24%时，感官评分逐渐下降。当初始可溶性固形物含量在16%～28%范围内增加时，酒精度逐渐增加，但初始可溶性固形物含量为24%、28%时，其酒精度差异不大；当初始可溶性固形物含量＞28%时，酒精度逐渐下降。其原因可能是，初始可溶性固形物含量较低时，产生的酒精度也较低，导致了五味子蜂蜜酒酒体不丰满，感官评分较低；当初始可溶性固形物含量较高时，发酵液渗透压较高，会明显抑制发酵[24]，导致发酵结束后的可溶性固形物含量较高，酒精度较低。较高的残糖量也会导致酒体甜味过重，影响口感，感官评分较低。此外，也会影响货架期。综合考虑，最适初始可溶性固形物含量为24%。

2.1.3 酵母接种量对五味子蜂蜜酒品质的影响

酵母接种量对五味子蜂蜜酒品质的影响见图3。

图3 酵母接种量对五味子蜂蜜酒品质的影响Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of S.chinensis mead

由图3可知，随着酵母接种量在0.05%～0.25%范围内的增加，酒精度逐渐上升，而可溶性固形物含量下降。当酵母接种量在0.05%～0.15%范围内的增加，感官评分逐渐增加；当酵母接种量为0.15%时，感官评分达到最大值，为84分；当酵母接种量＞0.15%时，感官评分逐渐下降。酵母接种量越高，发酵越彻底，酒精度越高，发酵结束时可溶性固形物含量越低，但过高的酵母接种量会使酒液产生不悦口感，使感官评分降低。综合考虑，最适酵母接种量为0.15%。

2.1.4 初始pH值对五味子蜂蜜酒品质的影响

初始pH值对五味子蜂蜜酒品质的影响见图4。

图4 初始pH值对五味子蜂蜜酒品质的影响Fig.4 Effect of initial pH on the quality of S.chinensis mead

由图4可知，随着初始pH值在3.0～4.0范围内的增加，可溶性固形物含量快速下降，而感官评分与酒精度快速上升；初始pH值为4.0时，可溶性固形物含量为9.2%，感官评分为78分，酒精度为10.4%vol，当初始pH值＞4.0时，可溶性固形物含量下降趋势趋于稳定，感官评分与酒精度的上升趋势趋于平稳。其原因可能是，当初始pH值较低时，发酵结束时的可溶性固形物含量较高，酒精度也比较低。酵母生长受到了严重的抑制，发酵速度缓慢，不利于风味物质的形成[26]。初始pH值较高时，对杂菌抑制作用减小，容易引起酒液风味变差，品质降低[27]。综合考虑，最适初始pH值为4.0。

2.2 发酵工艺条件优化响应面试验

在单因素试验结果的基础上，以感官评分（Y）为响应值，五味子含量（A）、初始可溶性固形物含量（B）、酵母接种量（C）和初始pH值（D）4个因素为自变量，采用响应面法进行优化，筛选出五味子蜂蜜酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process conditions optimization

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

对试验所得数据利用分析软件Design-Expert 13.0.1进行多元回归方程拟合，得到感官评分（Y）的二次多项回归模型方程为：

由表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.359 5＞0.05），说明构建的回归模型拟合较好。决定系数R2为0.935 1，说明该模型试验误差小，拟合程度好，调整决定系数R2adj为0.870 2，表示该模型可以解释87.02%的响应值变化。变异系数（coefficient of variation，CV）=2.54%＜5.00%，说明模型重现性较好。信噪比=12.872 8＞4，说明该模型很适合五味子蜂蜜酒的预测。由P值可知，一次项A、B，二次项A2、B2、C2、D2对五味子蜂蜜酒感官评分的影响极显著（P＜0.01）；一次项C、D，交互项AB对五味子蜂蜜酒感官评分的影响显著（P＜0.05），其他项对五味子蜂蜜酒感官评分的影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，4个因素对五味子蜂蜜酒感官评分的影响主次顺序为：五味子含量（A）＞初始可溶性固形物含量（B）＞酵母接种量（C）＞初始pH值（D）。

各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面及等高线见图5。

图5 各因素间交互作用对五味子蜂蜜酒感官评分影响的响应面及等高线Fig.5 Responses surface plots and contour lines of effects of interaction of each factors on sensory scores of Schisandrae chinensis mead

由图5可知，在该模型中，AB曲面较为陡峭，并且等高线呈现出椭圆形，说明其交互作用显著，固定酵母接种量和pH不变，感官评分随着五味子含量和初始可溶性固形物的增多呈现先增大后降低的趋势，存在极值。而AC、AD、CD、BD、BC交互作用不显著。这与方差分析结果一致。

由Design-Expert 13.0.1软件预测得出五味子蜂蜜酒最佳发酵工艺条件为：五味子含量1.93%、初始可溶性固形物含量24.77%、酵母接种量0.158%、初始pH值为4.08，感官评分理论值为84.88分。为了便于实际生产操作，将五味子蜂蜜酒发酵生产工艺修正为：五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接种量0.16%、初始pH值4.0。在此优化条件下进行6次平行验证试验，五味子蜂蜜酒的感官评分实际值为84.20分，实际值与预测值相差不大，表明该回归模型可靠，具备应用价值。

2.3 五味子蜂蜜酒理化及微生物指标检测结果

对五味子蜂蜜酒理化指标进行测定，其酒精度为11.2%vol，总糖（以葡萄糖计）为24.6 g/L，总酸（以酒石酸计）为6.1 g/L，可溶性固形物含量为8.8%。五味子蜂蜜酒中主要功能成分木脂素总含量为0.062 g/100 g，总多糖含量为0.047 g/100 g；五味子蜂蜜酒的菌落总数为42 CFU/mL，大肠菌群未检出。

2.4 五味子蜂蜜酒挥发性香气成分的GC-MS/MS分析

采用气相色谱-质谱/质谱联用法分析五味子蜂蜜酒中挥发性香气物质，检测结果见表5。

表5 五味子蜂蜜酒挥发性香气成分GC-MS/MS检测结果Table 5 Determination results of volatile aroma components in Schisandra chinensis mead analyzed by GC-MS/MS

由表5可知，五味子蜂蜜酒共鉴定出挥发性香气成分17种，其中酯类6种，醇类7种，烯类3种，醚类1种。其主体风味成分是醇类（75.25%）、烯类（10.48%）、酯类（9.85%）。醇类如乙醇、苯丙醇、橙花叔醇等赋予了酒液突出的酒香与果香[28]；萜烯类物质感官阈值较低，对酒液香气形成也十分重要[29]；酯类如乙酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯等赋予了酒液独特而又复杂的水果香味[30]。其中，乙醇相对含量最高，占比34.95%，其次分别为苯丙醇（23.31%）、2-甲基丁醇（12.31%）、D-柠檬烯（7.92%）、己酸乙酯（4.3%）、辛酸乙酯（2.12%）等。

3 结论

本研究以五味子和蜂蜜为主要原料制备五味子蜂蜜酒，以感官评分作为评价指标，通过单因素试验及响应面试验确定五味子蜂蜜酒最佳发酵工艺条件为：五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接种量0.16%、初始pH值4.0。在此优化条件下，五味子蜂蜜酒的感官评分为84.2分，酒精度为11.2%vol，总糖（以葡萄糖计）为24.6 g/L，总酸（以酒石酸计）为6.1 g/L，可溶性固形物含量为8.8%，主要功能性物质木脂素总含量为0.062 g/100 g，总多糖含量为0.047 g/100 g。其主要的香气物质为乙醇、苯丙醇、2-甲基丁醇、D-柠檬烯和己酸乙酯。五味子蜂蜜酒呈琥珀色，清澈透亮，蜜香、酒香突出，口感浓厚，酒体丰满，有轻微苦涩感，整体风格突出。本研究通过优化五味子蜂蜜酒发酵工艺条件，为五味子蜂蜜酒的后续生产提供一定的参考意义。