孙珊珊 王亦周 王淑娟 魏丽萍 胡 杨 王亮生,*
(1中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室,北京 100093;2国家植物园,北京 100093;3中国科学院大学,北京 100049;4神农智华生物科技(山西)有限公司,山西 长治 046011;5内蒙古农业大学沙漠治理学院,内蒙古 呼和浩特 010018)
花粉是植物的雄性生殖细胞,几乎包含了自然界的全部营养物质和人体所需要的营养素,有“微型营养库”之称[1]。具体表现为,花粉中蛋白质含量丰富,比牛肉、鸡蛋高出5~7 倍;氨基酸种类多,含有8 种人体必需氨基酸[2-3];此外,花粉中矿物质元素含量较高,对易缺钙、铁、锌等元素的中国人来说,是很好的补充剂[4]。我国中药学家叶桔泉教授认为:“花粉是多功能全方位地治疗与保健的天然珍奇宝物,是一种新型的高级营养品”[2]。
牡丹(Paeonia×suffruticosa)是芍药科芍药属多年生落叶灌木,是我国特有的观赏、药用、油用作物,在我国已有2 000 多年的栽培历史。自2011年3 月国家卫生健康委员会发布关于批准牡丹籽油作为新资源食品的公告以来,牡丹的开发利用得到了大力发展,种植面积达到近百万亩[5]。牡丹全身是宝,其根、茎、叶、花和籽的研究开展较早,在食品、医疗、保健品等行业展现出较好的前景[6]。但每年产量估计可达数千吨的牡丹花粉[5],却因研究力度小而被大量浪费。目前牡丹花粉研究中仍存在以下问题:1)牡丹花粉营养成分报道较少[5,7-8];2)花粉收集过程中会产生大量的花药壁(花药去掉花粉后剩余部分),花药壁可能存在与花粉相似的营养成分,但由于未被研究而造成资源浪费;3)花粉的外壁素有盔甲之称[9],花粉成分检测时是否需要破壁仍未有定论;4)不同花发育时期,花粉和花药壁中营养成分含量可能存在差异,合理的采收时间也需要明确。
基于上述问题,本研究以油用牡丹主栽品种凤丹(Paeonia ostiiFengdan)花粉和花药壁为研究对象,通过凯氏定氮法[10]、电感耦合等离子体发射光谱[11]、氨基酸分析仪[12]、高效液相色谱[13]等对其蛋白质、水解氨基酸、游离氨基酸、矿物质元素、维生素C 等营养成分进行了全面系统分析,同时对其破壁和采收时期进行探讨,旨在为凤丹花粉、花药壁在食品、保健品等领域的开发和利用提供数据支撑。
于2019年4月中旬在山西长治市牡丹种植区采集硬蕾期(S1)、露色期(S2)、初开期(S3)三个时期的凤丹花药[14],带回实验室后在室温条件下(20~25 ℃)自然通风干燥,然后反复过筛将花药分成花粉和花药壁两部分。机械粉碎,过80 目筛,在真空冷冻干燥器中干燥2 d,置于冰箱内-20 ℃低温保存。
硫酸铜、浓硫酸、硝酸、磷酸、过氧化氢、盐酸、茚三酮,上海国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠、L-半胱氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;冰醋酸,北京市通广精细化工公司;无水乙醇(色谱纯),美国Fisher Scientific公司。标准品:磷溶液储备液(1 000 μg·mL-1)、无机元素混标储备液(Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Ni、Zn,50 μg·mL-1;Na、K、Ca、Al、Se,100 μg·mL-1),中国计量科学研究院;L-抗坏血酸标准品,汕头市西陇科学股份有限公司;D-异抗坏血酸标准品,北京索莱宝科技股份有限公司;氨基酸混合标准溶液(H 型、AN-2型和B型),日本和光纯药工业株式会社。
Agilent 1260 型高效液相色谱仪,美国Agilent 公司;Kjeltec™ 2200 型凯氏定氮仪,美国FOSS 公司;iCAP 6000 series 电感耦合等离子体发射光谱,美国Thermo Fisher Scientific 公司;mars 6 classic 微波消解仪,美国cem 公司;Milli-Q 超纯水仪,美国密里博公司;Scientz-10N 型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;L-8900 型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;DGG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;HN 200 型氮吹仪,济南海能仪器有限公司。
采用温差法[15]对收集的凤丹花粉和花药壁进行破壁处理:称取适量花粉和花药壁,在多层锡箔纸的包裹下放入-70 ℃冰箱内冷冻24 h,取出后迅速放入95 ℃水浴锅中水浴10 min进行温差破壁。
1.4.1 蛋白质含量测定 参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[16]中凯氏定氮法对凤丹花粉和花药壁中蛋白质含量进行测定。
1.4.2 矿物质元素含量测定 参照《GB 5009.268-2016食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[17]中电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)对凤丹花粉和花药壁中矿物质元素含量进行测定。
1.4.3 水解氨基酸含量测定 参照《GB 5009.124-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[18],使用氨基酸分析仪对凤丹花粉和花药壁中水解氨基酸含量进行测定。
1.4.4 维生素C 含量测定 参照《GB 5009.86-2016食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》[19],使用高效液相色谱仪对凤丹花粉和花药壁中维生素C含量进行测定。
1.4.5 游离氨基酸含量测定
1.4.5.1 样品前处理 准确称取凤丹花粉、花药壁样品各0.25 g于15 mL离心管中,加入5 mL纯净水,超声10 min 后以10 000 r·min-1离心15 min,取上清定容至5 mL 容量瓶内。取1 mL 溶液加入8%磺基水杨酸1 mL,再次以10 000 r·min-1离心15 min,然后取1 mL上清液氮气吹干,用1 mL 盐酸(0.02 mol·L-1)复溶,混匀后过0.22 μm膜,上机测定。
1.4.5.2 色谱条件 855-4507 型阳离子交换树脂(4.6 mm×60 mm);分离柱柱温38 ℃;反应柱柱温135 ℃;流动相流速0.35 mL·min-1;茚三酮流速0.3 mL·min-1;进样量20 μL;检测波长:440 nm(羟基脯氨酸和脯氨酸)和570 nm(其余氨基酸);检测时间125 min。
1.4.5.3 标准曲线的绘制 将混合标准品溶液用0.02 moL·L-1的盐酸稀释,使其浓度分别为75、125、150、175、200 nmoL·mL-1,按上述色谱条件上机测定。以氨基酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
采用Microsoft Excel 2021 和SPSS 26.0 等软件进行数据处理和统计分析,所有样本均做3 次重复,试验数据采用ANOVA 分析并采用Duncan’s 多重比较法进行样品间显著性差异分析(P<0.05)。
2.1.1 蛋白质和水解氨基酸含量分析 蛋白质是生命的物质基础,是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者。植物中蛋白质含量最高的部位是花粉,其含量一般在7%~40%之间[8]。由表1可知,凤丹花粉中蛋白质含量高达40.68%(初开期,以下营养成分含量皆为破壁前),花药壁蛋白质含量为20.89%(露色期),花粉是花药壁的2倍。
表1 不同时期凤丹花粉、花药壁破壁前后蛋白质和水解氨基酸分析Table 1 Analysis of protein and hydrolyzed amino acids of pollen and anther wall of Fengdan before and after wall breaking in different stages/(mg·g-1 DW)
氨基酸是构成蛋白质的基本单位,本研究对凤丹花粉、花药壁中17 种氨基酸进行检测(图1、表1)。结果显示,花粉中水解氨基酸总含量高达355.65 mg·g-1(初开期),花药壁(160.43 mg·g-1,硬蕾期)约是花粉的一半,这与二者蛋白质含量一致。其中,花粉水解氨基酸含量为谷氨酸>天冬氨酸>赖氨酸>亮氨酸>丙氨酸>缬氨酸>精氨酸;花药壁为谷氨酸>天冬氨酸>丙氨酸>赖氨酸>亮氨酸>精氨酸>缬氨酸,且二者检测的17 种氨基酸中都含有7 种必需氨基酸(色氨酸在酸性条件下易分解,未被检测到),其含量占总氨基酸含量的40%左右。
图1 凤丹花粉、花药壁水解和游离氨基酸色谱图Fig.1 Chromatograms of hydrolyzed and free amino acids in pollen and anther wall of Fengdan
2.1.2 不同采收时期和破壁因素考察 就蛋白质和水解氨基酸含量而言,凤丹花粉在初开期较高,花药壁在硬蕾期较高,但二者在不同花发育时期,蛋白质和水解氨基酸含量无显著差异。若二者同时采收初开期更适合。破壁前后比较可以看出,破壁对凤丹花粉和花药壁蛋白质检测含量无明显影响,这可能是因为在蛋白质检测过程中,高温消解使反应充分,不需要对样品提前破壁。对于水解氨基酸,破壁也未使花粉、花药壁中总氨基酸检测含量提高。因此进行凤丹花粉、花药壁蛋白质和水解氨基酸分析时可不考虑破壁对其含量的影响。
2.2.1 游离氨基酸含量分析 植物体内的氨基酸以结合态和游离态两种形式存在[20]。相较结合态氨基酸在食用过程中不能被立即水解,游离氨基酸更易被人体吸收[21]。本研究对凤丹花粉、花药壁中36种游离氨基酸进行测定(图1),并从总氨基酸(total amino acids,TAA)、必需氨基酸(essential amino acids,EAA)、蛋白氨基酸(protein amino acids,PAA)、非蛋白氨基酸(non-protein amino acids,NPAA)、甜味氨基酸(sweet amino acids,SAA)、鲜味氨基酸(umami amino acids,UAA)、苦味氨基酸(bitter amino acids,BAA)、芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAA)等几个方面对其游离氨基酸营养价值进行分析[20,22-23]。由表2 可知,凤丹花粉中共检测到30 种游离氨基酸,其总含量为2 377.18 mg·100 g-1(露色期,下同),其中必需氨基酸7 种(含量为543.86 mg·100 g-1)、蛋白氨基酸16 种(1 897.65 mg·100 g-1)、非蛋白氨基酸14 种(479.53 mg·100 g-1),且EAA/TAA 为22.88%,PAA/TAA 为79.83%。由于花粉营养成分丰富,可作为保健品或食品开发,因此味觉也作为一项重要指标被参考。通过分析可知,凤丹花粉含有甜味氨基酸7种、鲜味氨基酸3种、苦味氨基酸6种、芳香族氨基酸3种,鲜甜氨基酸占总氨基酸含量的66.71%(硬蕾期),芳香族氨基酸占总氨基酸含量的4.42%(硬蕾期),说明凤丹花粉有较好的鲜甜口感。凤丹花药壁(初开期破壁前)中共检测到29 种游离氨基酸,其总含量为2 704.68 mg·100 g-1(初开期,下同),其中必需氨基酸7种(304.29 mg·100 g-1)、蛋白氨基酸15 种(1 651.93 mg·100 g-1)、非蛋白氨基酸14 种(1 052.74 mg·100 g-1),且EAA/TAA 为11.25%,PAA/TAA 为61.08%。同时凤丹花药壁含有甜味氨基酸7 种、鲜味氨基酸3 种、苦味氨基酸6 种、芳香族氨基酸2 种,鲜甜氨基酸含量占总氨基酸含量的61.69%(露色期),芳香族氨基酸占总氨基酸含量的2.26%(露色期)。二者呈味氨基酸组成模式如图2 所示。综上,基于游离氨基酸数值,花粉在营养价值和食用口感上较花药壁更好一些,但二者数值接近,可同样被开发利用。
图2 凤丹花粉、花药壁呈味氨基酸组成模式图Fig.2 Comparative profiles of taste-active amino acids in pollen and anther wall of Fengdan
表2 不同时期凤丹花粉、花药壁破壁前后游离氨基酸分析Table 2 Analysis of free amino acids of pollen and anther wall of Fengdan before and after wall breaking in different stages/(mg·100 g-1 DW)
表2(续)
表2(续)
2.2.2 不同采收时期和破壁因素考察 考察发现,凤丹花粉中总游离氨基酸、必需氨基酸、蛋白氨基酸在露色期含量较高,初开期次之,而花药壁则在初开期较高,露色期次之。若二者同时采收,较合理的采收时期为初开期。破壁前后比较可以看出,破壁未使花粉、花药壁游离氨基酸的检测含量提高,反而多数氨基酸在破壁前的检测含量较破壁后稍高。可见凤丹花粉、花药壁游离氨基酸检测时并不需要破壁。
2.3.1 矿物质元素含量分析 花粉中含有丰富的矿物质元素,这些元素参与人体酶、维生素、激素等的合成和代谢,具有重要的生理活性[24]。本研究对凤丹花粉、花药壁13 种矿物质元素进行检测,其中常量元素包括钾K、磷P、钙Ca、镁Mg、钠Na;微量元素包括:人体必需微量元素(锌Zn、硒Se、铜Cu、铬Cr、铁Fe),人体可能必需元素(锰Mn、镍Ni)以及具有潜在毒性元素(铝Al)[25],结果见表3。
在常量元素中,K 能调节心脏节律和维持神经肌肉的正常功能[26]。Ca是构成骨骼和牙齿的主要成分,并参与激素分泌[27]。Mg 是许多酶的辅酶,参与蛋白质的合成并与肌肉的收缩有关[27]。如表3 所示,凤丹花粉中含有丰富的常量元素,其含量为K>P>Ca>Mg>Na,其中K 含量超过11 833.31 mg·kg-1(初开期),Ca、Mg的含量分别为4 577.76和2 083.87 mg·kg-1(初开期)。与花粉相比,花药壁中常量元素含量更高,其中K、Ca、Mg的含量约是花粉的2倍。
在微量元素中,Zn 参与多种酶的合成代谢,促进人体的生长发育[28];Fe 是过氧化氢酶、血红蛋白的重要组成成分[29];Cu 是激素和胰岛素的构成成分,参与碳水化合物、蛋白和脂类的代谢;Cr 可使胰岛素的活性增加,促进人体生长发育,防治动脉粥样硬化;Mn能够强壮骨骼,促进人体生长发育,防治心血管疾病[30]。如表3 所示,凤丹花粉中微量元素同样较丰富,其含量为Fe>Zn>Mn>Cu>Al>Cr,其中Fe 含量高达222.27 mg·kg-1(硬蕾期),Zn 为86.35 mg·kg-1(硬蕾期)。在花药壁中,各微量元素含量为Fe>Zn>Cu>Al>Mn>Ni>Cr,但花粉的微量元素含量整体高于花药壁。
表3 不同时期凤丹花粉、花药壁破壁前后矿物质元素分析Table 3 Analysis of mineral elements of pollen and anther wall of Fengdan before and after wall breaking in different stages/(mg·kg-1 DW)
2.3.2 不同采收时期和破壁因素考察 考察发现,凤丹花粉、花药壁中13 种矿物质元素在不同花发育时期的变化趋势不一致,但就整体而言,二者矿物质元素含量均在露色期和初开期较高。破壁前后比较可以看出,除个别元素外,破壁会使花粉、花药壁矿物质元素检测含量增多,但破壁前后整体无显著差异。因此,破壁并不是凤丹花粉、花药壁矿物质元素检测的必要条件。
2.4.1 维生素C 含量分析 维生素C(vitamin C,Vc)是人体每日膳食推荐供应量最大的一种维生素,人体自身不能合成,只能从食物中摄取。Vc 主要包括还原型L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid,L-Vc),脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbic acid,脱氢L-Vc)和D-异抗坏血酸(D-Isoascorbic acid,D-Vc)三种构型,而D-Vc 的活性仅为L-Vc 的5%[13]。但目前Vc 检测中存在L-Vc 和D-Vc 分离不佳,或仅以L-Vc 来代表Vc 总含量等问题。针对上述问题本研究实现了对凤丹花粉、花药壁中Vc 色谱峰的较好分离(图3),并通过还原反应测得脱氢L-Vc和总Vc的含量。
图3 凤丹花粉、花药壁维生素C色谱图Fig.3 Chromatogram of vitamin C in pollen and anther wall of Fengdan
由表4 可知,凤丹花粉、花药壁3 种抗坏血酸成分中L-Vc 的含量最高,脱氢L-Vc 次之,D-Vc 同大多数水果、蔬菜一样未被检测到。花粉和花药壁脱氢L-Vc的含量分别为211.98 mg·kg-1(硬蕾期)和67.40 mg·kg-1(露色期),可见凤丹花粉、花药壁Vc检测时把脱氢L-Vc的含量考虑在内才能更准确地反映其总Vc 的含量。最终测得凤丹花粉总Vc 含量为804.07 mg·kg-1(硬蕾期),花药壁为615.49 mg·kg-1(露色期)。
表4 不同时期凤丹花粉、花药壁破壁前后抗坏血酸分析Table 4 Analysis of ascorbic acid of pollen and anther wall of Fengdan before and after wall breaking in different stages/(mg·kg-1 DW)
2.4.2 不同采收时期和破壁因素考察 不同花发育时期,凤丹花粉总Vc 含量差异不大,而花药壁总Vc 含量存在显著性差异,尤以露色期含量最高,初开期次之。因此就Vc总含量而言,二者同时采收露色期较为合适。破壁前后比较可以看出,花粉和花药壁破壁前总VC、L-Vc 和脱氢L-Vc 含量均显著高于破壁后。原因可能是抗坏血酸化合物结构稳定性差,高温或光照条件下易发生氧化反应而被降解,从而造成破壁后Vc检测含量降低。因此温差破壁不适用于样品中Vc 含量的检测。
花粉在众多保健食品资源研究中历来受到重视,被认为是本世纪有前景的食物资源。牡丹花朵大,花粉产量高,但关于其营养成分分析的研究较少,仅有少量有关花粉水解氨基酸和矿物质元素的报道[5,7-8]。本研究同时对凤丹花粉和花粉中蛋白质、水解氨基酸、游离氨基酸、矿物质元素、Vc 进行了系统地分析和评价,其中花粉游离氨基酸、Vc 及花粉营养成分分析均为首次报道。本研究发现,凤丹花粉中蛋白质含量高达40.68%(初开期),是花粉平均蛋白质含量(约24%[31])的近2倍;是牡丹花瓣蛋白质含量(6.25%~21.53%[5])的2~6 倍;比鸡蛋(约13%[32])高出2 倍;比牛奶(约3%[33])高出近10 倍。而凤丹花药壁的蛋白质含量为21.12%,虽仅为花粉蛋白质含量的一半,但同普通高蛋白食物相比也偏高,表明凤丹花粉和花药壁可作为高蛋白食品来源。氨基酸是构成蛋白质的基本单位,而蛋白质营养价值的高低主要取决于所含必需氨基酸的种类、含量及比例是否与人体所需接近,根据联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)提出的理想蛋白模式,当必需氨基酸与总氨基酸的比值(EAA/TAA)达到40%时,可作为优质蛋白来源[34]。凤丹花粉和花药壁EAA/TAA 分别为43.69%和39.94%(硬蕾期),二者EAA/TAA 值都在40%左右,符合FAO/WHO 提出的理想蛋白模式。因此,凤丹花粉、花药壁可作为优质蛋白来源。36 种游离氨基酸分析结果表明,凤丹花粉、花药壁中含有的游离氨基酸种类相似,但花药壁总游离氨基酸和非蛋白氨基酸含量较花粉稍高,而花粉必需氨基酸、蛋白氨基酸和鲜甜氨基酸含量较花药壁更高。因此就游离氨基酸而言,花粉在营养价值和食用口感上比花药壁更好,但二者数值接近,花药壁同样可作为花粉的替补品被加以利用。
13种矿物质元素分析结果表明,凤丹花粉和花药壁中含有丰富的常量元素和微量元素。在常量元素中,花粉K、Ca、Mg 的含量是玉米、野菊、油菜、玫瑰、荷花、茶花、松花等花粉的几倍[27],比牡丹籽油中矿物质元素含量高出几倍到几十倍[35],其中Ca含量(4 577.76 mg·kg-1,初开期)高于常见的高钙食物如大豆(1 910 mg·kg-1)、牛奶(1 040 mg·kg-1)、鸡蛋黄(1 120 mg·kg-1)[36]。而花药壁常量元素含量比花粉更高,其K、Ca、Mg 含量约是花粉的2 倍。临床试验表明,K/Na>1 有助于维持机体的酸碱平衡,且高K 低Na 对预防和治疗高血压、肾脏疾病有一定的益处[28,37],凤丹花粉中K/Na 高达55,花药壁K/Na 超过120,二者均可作为高K 低Na 食品进行开发。在微量元素中,凤丹花粉Fe、Zn 含量较高,是五味子、银杏、野菊、虞美人、油菜、荷花、茶花等花粉的2到3倍[27],其中Zn含量(86.35 mg·kg-1,硬蕾期)高于大豆(37.1 mg·kg-1)、花生(39.2 mg·kg-1)、小米(25.1 mg·kg-1)等高锌食物[4]。我国人群中缺Fe 缺Zn现象普遍,凤丹花粉Fe、Zn 含量较高,是补Fe 补Zn 的佳品。虽然花药壁Fe、Zn 含量仅为花粉的1/2,但仍高于百合、益母草、荷花、茶花等花粉[27]。此外,凤丹花粉和花药壁中Zn、Cu含量均呈Zn高Cu低现象,这与癌症患者血清中Zn 低Cu 高的现象相反,因此凤丹花粉、花药壁具有调节癌症患者体内铜锌平衡的作用[38]。值得注意的是,花粉中Al 元素含量较高,研究表明人体摄入过多的铝会导致骨质疏松、智力下降[30,39],但花粉中Al元素含量普遍在100 mg·kg-1以上,尤其是松花粉中Al含量高达416.7 mg·kg-1,因此成年人长期服用松花粉应不大于8 g·d-1[27]。凤丹花粉、花药壁中Al元素含量在16.21~35.80 mg·kg-1之间,较大多数花粉低。因此就有益元素含量和低Al 元素含量而言,凤丹花粉、花药壁在矿物质元素开发上比其他花粉更有潜力。
Vc主要包括还原型L-抗坏血酸,脱氢抗坏血酸和D-异抗坏血酸三种异构体,多数食品Vc分析中仅用还原型L-抗坏血酸代表食品中总Vc的含量,而忽视了脱氢抗坏血酸的含量。本研究对三种Vc 异构体进行分析,结果显示凤丹花粉、花药壁中总Vc含量是油菜蜂花粉的2~3倍[40],也比柚子、桔子、芒果、西红柿、洋葱等水果蔬菜高[41],因此凤丹花粉、花药壁可作为Vc补充剂。
此外,本研究首次分析了凤丹花粉、花药壁不同采收时期及破壁对其营养成分含量的影响,结果显示凤丹花粉、花药壁不同营养成分含量在不同花发育时期会有所差异,但二者整体在露色期和初开期含量较高,尤以初开期为最佳采收时期。破壁会使花粉、花药壁中细胞壁破裂,对于较温和的试验条件而言,破壁利于样品中成分的检测。但在本试验所测营养成分中,破壁未使其含量显著提高,可能是因为试验条件足够使样品中营养成分得到释放,并不需要额外对样品进行破壁处理,因此在该成分检测时可不考虑破壁操作。
凤丹花粉和花药壁中蛋白质、水解氨基酸、游离氨基酸、矿物质元素、Vc等营养成分含量丰富,具有开发为食品或保健品的潜质,而花药壁的平行研究利于牡丹资源的挖掘。破壁因素考察发现,在分析上述营养成分时样品不需要额外破壁处理。不同采收时期相比,凤丹花粉、花药壁同时采收以初开期营养成分含量最高。本研究为凤丹花粉、花药壁深度开发利用提供了数据支撑,也为其他植物花粉、花药壁的营养成分分析提供了参考。