陈玉静 丁一倩 周明兵
(浙江农林大学,省部共建亚热带森林培育国家重点实验室,竹子研究院,浙江 杭州 311300)
植物细胞中,除可编码蛋白的信使RNA(mRNA)以外,还存在着诸多类型的非编码RNA,包含核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、反式作用tasiRNA、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和环状RNA(circRNA)等[1]。其中circRNA广泛参与胁迫响应,逐渐成为近几年的研究热点。
circRNA 第一次被发现是在高等植物的类病毒中[2-3]。随着高通量测序和生物信息学的发展,在古菌、秀丽线虫、小鼠、大鼠和人类中同样发现了大量环状RNA[4-5]。虽然circRNA 在植物中被首次鉴定[6],但植物circRNA 的研究相对落后。近几年circRNA 在单子叶植物水稻[7]、小麦[8]和玉米[9],双子叶植物拟南芥[10]、茶树[11]、沙棘[12]、苎麻[13]等植物中相继被发现。为了大规模鉴定circRNA,很多预测circRNA 的软件被开发出来,如CIRI2[14]、CIRI-full[15]、CircAST[16]、find_circ[17]、CircRNAwrap[18]等均为用于预测动物circRNA 的软件;CircPlant[19]和PCirc[20]是特异性针对植物circRNA 的鉴定软件,能更准确、有效地识别植物中的circRNA。
目前已有研究表明,circRNA 在受到非生物胁迫时会发生差异表达。例如,拟南芥在弱光和强光胁迫后,circRNA发生明显的差异表达[1];在盐胁迫下,对黄瓜进行circRNA 分析,发现有差异表达[21];在高温胁迫下,circRNA 在番茄叶片中的表达量也有所上升或者下降[22]。非生物胁迫不仅会使circRNA 表达量发生改变,而且会影响前体mRNA 的选择性剪接,进而影响circRNA的形成[16]。
有证据表明circRNA是细胞不同RNA互作的网络重要组成部分。所有包含miRNA 结合位点的RNA 转录本可以通过竞争共享与miRNA 的相互作用[6]。与miRNA 竞争性结合,从而调控mRNA 的非编码RNA称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)[23-25]。第一个ceRNA 是在拟南芥中发现的,该研究表明非编码RNA IPS1 可以通过与miR399 结合来影响PHO2的表达水平[26]。近期同样有研究表明circRNA 是ceRNAs的重要成员,通过miRNA 调节靶基因的表达。例如,有报道发现CircFN1可以通过CircFN1-miR-19a/b-3p-ATF2网络调控氧化应激诱导的滋养细胞凋亡以及增殖和迁移[27]。
毛竹在我国分布极其广泛,是集众多功能于一体的笋材两用竹种。目前,关于circRNA 参与毛竹生长发育的研究已经取得了一定进展。转录组测序发现,毛竹的开花植株比3 周龄幼苗、1 岁植株、明年开花植株和小花中存在数量更多的circRNA;circRNA 的侧边内含子在长末端重复(long terminal repeat,LTR)反转座子中存在高甲基化和富集,说明circRNA 参与了毛竹开花的调控[28]。另有研究也发现,circRNA 可以通过与miRNA 和mRNA 的调控网络相互作用,参与毛竹竹笋的生长[29]。
吴佳军[30]前期构建了低温、高温、紫外、高盐等4种胁迫全转录组数据库。为研究毛竹响应胁迫机制,本研究利用上述4种胁迫全转录组数据库,筛选并鉴定在紫外(ultar-violet,UV)胁迫和高温下都差异表达的1个circRNA,命名为PhcircRNA1;分析与PhcircRNA1协同表达的miRNA 和mRNA,构建circRNA - miRNA - mRNA调控网络,研究PhcircRNA1参与毛竹胁迫响应和根尖中生长发育调控的机制,以期为circRNA 调控毛竹的生长发育提供新思路。
毛竹(Phyllostachys edulis)种子均采自广西桂林市灵川县同一株母竹。剥好的种子用反渗透水浸泡3 d后,再用10%次氯酸钠浸泡消毒,之后在垫上滤纸的培养皿中催芽培养后,再移栽到盆里,培养基质为泥炭:蛭石:珍珠岩,体积比例为3∶1∶1。
毛竹长至五叶一心时期,将其暗处理3 d后进行胁迫处理。胁迫处理条件:1)42 ℃高温胁迫(4、6、8 h)[31];2)紫外胁迫(2、4、6 h)[32];对照(CK)培养条件为正常光照下28 ℃培养,取五叶一心叶片进行液氮速冻,存于-80 ℃冰箱。毛竹种子催芽处理后,将其水培培养。根据毛竹根生长的发育规律,待毛竹主根长至0.5~1 cm时,以水培15、30、35 d 的0.5 mm 左右根尖作为材料[33-35],进行液氮速冻后于-80 ℃冰箱中储存备用。提取RNA时,每管使用6株毛竹的根尖。所有样品均设置3次生物学重复。
采用天根生化有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取RNA。RNA 反转录为cDNA 的试剂盒分为两种:Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司],和miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);反转录miRNA 所用茎环引物:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACGTGCCC-3',同时加入5.8S rRNA 的下游引物一起进行反转录。最后将得到的cDNA 保存在-20 ℃冰箱备用。
使用find_circ[17]软件对毛竹中circRNA 进行预测。首先从全转录组测序数据[30]的毛竹基因组中不能比对上的序列片段(reads)两端各取20 bp 作为锚点,将锚点作为reads 与基因组进行比对,当锚点比对位置与转录本中位置相反时,延长锚点read 直至找到circRNA 接合位置。选择在两端序列存在GT/AT 剪接信号,且片段数量(read count)大于等于2 的circRNA作为候选circRNA。利用浙江农林大学周明兵课题组(本课题组)前期研究得到的4 种胁迫全转录组数据库[30],在该毛竹circRNA数据库中,以|log2 fold change|≥1且P<0.05 作为筛选标准,筛选了1 个在紫外胁迫和高温胁迫下都差异表达的circRNA,命名为PhcircRNA1。利用植物小RNA 标靶分析软件psRNATarget(v2)(参数设置:最大期待值设置为5,互补性评分长度设置为19),分析得到PhcircRNA1的靶miRNA,该miRNA 与miRNA156 成熟序列[35]只相差1 个碱基,命名为PhmiR156。用TargetFinder[36]软件对Ph-miR156 进行靶基因预测,再在4 种胁迫全转录组数据库[30]中筛选出在紫外和高温胁迫下均差异表达的靶基因。
设计引物前,先将5'端和3'端各自截取300 bp 序列,将3'端截取的序列置于5'端头部,形成一个新序列,用Primer 5.0 软件设计跨环化位点的发散引物(divergent primers)。
核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)是一种来源于大肠杆菌RNR 超家族的3'→5'核糖核酸外切酶,可从3'→5'方向将RNA 逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子,但不易消化环形RNA[37]。将0.5 μL RNase R加入到2.5 μg毛竹RNA 中,37 ℃孵育30 min,把消化后的RNA 反转录为cDNA,用发散引物鉴定PhcircRNA1稳定性。
PhcircRNA1和靶基因用普通反转录得到的cDNA作为模板,NTB作为内参,用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]进行PhcircRNA1和靶基因定量分析,通过Primer 5.0 软件设计qRT-PCR 引物(表1)。miRNA(PhmiR156)用miRNA 反转录试剂盒得到的cDNA 作为模板,以5.8S rRNA 作为内参,利用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行miRNA 定量分析。利用qRT-PCR 和2-△△Ct法分析PhcircRNA1、miRNA(Ph-miR156)和mRNA 的相对表达量。反应体系共20 μL:10 μL SYBR,0.5 μL 上游引物,0.5 μL 下游引物,1 μL cDNA,8 μL ddH2O。反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s,60 ℃复性30 s,共40个循环。
表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of the primers for qRT-PCR
使用find_circ[35]软件对毛竹中circRNA 预测后,结合4种胁迫全转录组数据库[30],以|log2 fold change|≥1且P<0.05作为筛选标准,筛选出在紫外胁迫和高温胁迫下都差异表达的1 个circRNA,其前体序列位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 体 (80360941~0361611、80385866~80388941),经过反向剪接形成了由6 个外显子和4 个内含子组成的外显子-内含子型circRNA(exon-intron circular RNA,EIciRNA),并命名为PhcircRNA1(图1-A)。利用植物小RNA 标靶分析软件psRNATarget鉴定出与PhcircRNA1有17个互补配对碱基的1 个靶miRNA(图1-B),该miRNA 与水稻miRNA156 相差1 个碱基(图1-C),命名为PhmiR156。用TargetFinder[36]软件对Ph-miR156 进行靶基因预测后,筛选出紫外胁迫和高温胁迫(42 ℃)下均差异表达的4 个靶基因(图1-D):PH02Gene02319(Glutamate Receptor - Like Gene 3.1,GLR3.1),PH02Gene31266(Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC28),PH02Gene28384(Cyclic Nucleotide-Gated Channel 8,CNGC8)和PH02Gene33036(Vernalization Insensitive 3-Like 1,VIL1)(图2)。
图1 PhcircRNA1的鉴定Fig.1 Identification of PhcircRNA1
图2 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在不同胁迫处理下的表达分析Fig.2 Expression analysis of PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA in different stress treatments
在RNase R 消化处理后反转录得到cDNA,分别用内参NTB的定量引物和PhcircRNA1的发散引物进行PCR。结果显示,RNase R 消化组中的NTB条带明显变淡,表明RNase R 对total RNA 中线性RNA 具有消化作用,而PhcircRNA1基本上没有变化(图3-A)。将PhcircRNA1的PCR 扩增片段进行胶回收,测序比对结果证实了PhcircRNA1首尾相连的特征(图3-B),进一步证明PhcircRNA1符合环状RNA特征。
图3 PhcircRNA1成环验证Fig.3 Verification of PhcircRNA1 cyclization
为研究PhcircRNA1在紫外胁迫下的表达模式,对不同时间紫外处理下的PhcircRNA1进行差异表达分析。结果表明,在紫外胁迫(2、4、6 h)时,PhcircRNA1表达量呈先下降后上升趋势,而4 个靶基因PH02Gene 02319(GLR3.1)、PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene2 8384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)表达量也先降低后升高,与PhcircRNA1表达趋势一致,而Ph-miR156表达量呈先上升后下降趋势,与PhcircRNA1和靶基因表达趋势相反(图4)。表明PhcircRNA1表达量下降会引起Ph-miR156 表达量升高,进一步降低4 个靶基因的表达量。说明在紫外胁迫下,PhcircRNA1-PhmiR156-mRNA调控通路符合竞争性内源RNA机制。
图4 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在紫外胁迫下的表达模式Fig.4 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under ultraviolet stress
为研究PhcircRNA1在高温胁迫下的表达模式,对不同时间高温胁迫下的PhcircRNA1进行差异表达分析(图5)。结果发现,在高温胁迫(4、6、8 h)下PhcircRNA1表达量随着高温胁迫时间延长而降低,Ph-miR156 表达量呈升高趋势,而4 个靶基因PH02Gene02319(GLR3.1)、PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene28384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)表达量呈降低趋势,与PhcircRNA1表达趋势一致。结合上文PhcircRNA1在紫外胁迫下的变化,进一步证实了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA调控通路的真实性。
图5 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在高温胁迫下的表达模式Fig.5 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under high temperature stress
取毛竹生长不同时期(0、15、30、35 d)的根尖作为研究对象(图6-A)。通过qRT-PCR 分析GLR3.1表达模式的变化,在0~15 d 时,PhcircRNA1和GLR3.1表达量下降,15~30 d时表达量上升,30~35 d时表达量再次下降,Ph-miR156表达趋势与PhcircRNA1和GLR3.1表达趋势相反(图6-B),说明PhcircRNA1可能通过调控Ph-miR156和GLR3.1参与毛竹根尖的生长发育。
图6 PhcircRNA1在毛竹四个生长时期根尖的表达模式Fig.6 Expression patterns of PhcircRNA1 in moso bamboo root tip at four growth stages
circRNA 是一种具有多种生物学功能的新型调控RNA,在植物中大量分布,通常来自外显子、内含子以及基因间区域。本研究根据本课题组前期研究得到的转录组数据,筛选并鉴定到PhcircRNA1以及其调控的miRNA 和4 个靶基因,PhcircRNA1是由位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 体(80360941~0361611、80385866~80388941)的前体序列反向剪接形成的EIciRNA。在植物中,circRNA 的反向剪接位点侧翼序列中重复元件或反向互补区域的富集较少[38],具有更多的选择性剪接位点以及非规范反向剪接位点[39],在不同物种之间的保守性较低[40]。circRNA 作为ceRNAs,在miRNA 介导的转录后基因表达调控中发挥重要作用。如在拟南芥中,circRNAs 可能通过螯合影响与过氧化氢、植物激素和热应激有关基因的表达[41];在番茄中,circRNA45和circRNA47可能通过调节miRNA-mRNA 表达水平,在番茄抗性中起正调节作用,最终增强植物抗性[42]。但是circRNA 的研究主要集中在人类和动物疾病中[43],而在植物中circRNA 的研究相对较少,大量circRNA 及其功能需要进一步挖掘。
PhcircRNA1调控的miR156 是调控植物开花的重要因子[44],4 个靶基因中PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene28384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)均与植物开花相关[45-47],其中UBC28是泛素结合酶基因,可以编码一种新的RING finger 蛋白,在泛素蛋白酶体系统中参与了蛋白质降解的调控,影响烟草的生长发育[48]。在拟南芥中,UBC突变体在长日照和短日照条件下均表现出早花表型[45]。CNGC8是环状核苷酸化通道,有研究报道花粉管特异性环状核苷酸化通道(CNGC8)与钙调蛋白2 共同构成一个分子开关,该开关可根据细胞钙水平控制钙通道的开启或关闭,从而控制开花植物的花粉管生长[46]。VIL1是春化相关基因,短日照时通过染色质修饰可以抑制FLOWER LOUS M(FLM),从而促进拟南芥开花[47]。GLR3.1在水稻中可以编码一种典型的谷氨酸受体样蛋白,与根顶端分生组织(root apical meristem,RAM)中的细胞增殖和细胞存活有关,在水稻中GLR3.1的缺失会抑制根尖的伸长[49]。本研究结果表明,在紫外线胁迫和高温胁迫下,PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 在毛竹中均有差异表达,且PhcircRNA1与4 个靶基因表达趋势一致,与Ph-miR156 表达趋势相反。在高温胁迫下,PhmiR156 表达量上升,与在拟南芥中的研究结果一致[50-51]。4个靶基因的qRT-PCR结果与全转录组测序结果相同,在高温胁迫与紫外胁迫下表达量都呈现下降趋势,说明PhcircRNA1可能通过调控Ph-miR156 来调控靶基因的表达,参与毛竹的开花和生长发育。本研究展示了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA 调控通路,后期将通过双荧光素酶试验进一步验证该调控网络的准确性。
已有研究表明,毛竹根生长速率在15 d 时最快,30 d 变缓慢直至35 d 时趋于停滞[33]。本研究调查了PhcircRNA1在不同生长速率毛竹根尖的表达模式,结果表明PhcircRNA1和GLR3.1表达趋势一致,与PhmiR156 表达趋势相反。毛竹生长至15 d 时,PhmiR156 表达量最高,毛竹根长生长速率最高,说明PhcircRNA1通过Ph-miR156调控GLR3.1的表达,可能影响毛竹根的生长发育。但是PhcircRNA1如何通过调节Ph-miR156从而影响靶基因表达的具体机制仍有待进一步探究。
本研究鉴定了1 个参与毛竹高温胁迫和紫外胁迫的非编码调控RNA-PhcircRNA1,构建了PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 调控网络,推测PhcircRNA1可能作为Ph-miR156 海绵,调控GLR3.1的表达,在毛竹根尖的生长发育过程中发挥重要的调控作用。