急性脑梗死病人外周血单核细胞中Cx43、PPARγ表达与颈动脉粥样硬化的关系

黄健康，文洪波，缪家立

急性脑梗死在临床上也称为急性缺血性脑卒中，是临床上常见的脑血管疾病，目前大部分学者认为粥样斑块破裂或动脉粥样硬化是急性脑梗死主要病理基础[1]。临床上常用颈动脉内膜中层厚度(carotid artery intima-media thickness，CIMT)区分动脉粥样硬化的范围及程度[2]。目前研究认为动脉粥样硬化与血管内皮损伤、炎性反应息息相关[3]。外周血单核细胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)可黏附于血管壁，此过程伴随着大量炎性介质释放，从而促进动脉粥样硬化发生。有学者发现缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)可参与PBMCs黏附于血管内皮细胞过程，从而参与动脉粥样硬化的发生[4]。过氧化小体增殖剂激活型受体γ(peroxrisome prolifterator-activated receptor γ，PPARγ)可调节多种基因的转录与表达，从而参与多种病理过程。有学者发现PPARγ在动脉粥样硬化中起着关键作用[5]。目前Cx43和PPARγ在急性脑梗死动脉粥样硬化中的作用鲜有报道。基于此，本研究将分析急性脑梗死病人PBMCs中Cx43和PPARγ与CIMT的相关性，以期为急性脑梗死动脉粥样硬化防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2020年9月我院收治的125例急性脑梗死病人为研究对象(研究组)，其中，男69例，女56例；年龄40～70(60.34±11.27)岁。纳入标准：①符合急性脑梗死诊断标准[6]，且经磁共振成像(MRI)检测确实存在梗死病灶[7]；②首次脑卒中，且在发病3 d内就诊；③本人及家属均知晓此研究。排除标准：①出血性脑卒中、短暂性脑缺血发作病人；②严重肝、肾功能障碍病人；③免疫功能异常病人；④近3个月发生心肌梗死；⑤合并阿尔茨海默病、癫痫等神经性疾病病人。选择同期在本院体检健康者125名作为对照组，其中，男65名，女60名；年龄40～75(60.29±10.87)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集 收集所有研究对象体质指数(body mass index，BMI)及其他实验室指标：低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)，均应用日立7600-20型全自动化分析仪检测。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 研究组在入院次日清晨空腹时，对照组在体检当天空腹时，用肝素抗凝管抽取静脉血3～4 mL，直接置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 检测单核细胞中Cx43、PPARγ水平 取出冻存的外周血，解冻，离心，分离出上层血浆成分，向离心管中加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)及淋巴细胞分离液，梯度离心，获取PBMCs。采用Trizol法提取PBMCs总RNA，检测RNA浓度，反转录得到cDNA。采用CFX96实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪对Cx43、PPARγ及内参β-actin进行扩增反应。引物由上海生工合成。Cx43正向引物5′-GGCGTGAGGAAAGTACCAAA-3′，反向引物5′-ACGCCAAGTGATTGAACTCC-3′；PPARγ正向引物5′-TCCCGCTGACCAAAGCAAAGGC-3′，反向引物5′-CCACGGAGCGAAACTGACACCC-3′；内参β-actin正向引物5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，反向引物5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃，40 s；40个循环。对Cx43、PPARγ相对表达量用2-△△CT法计算。

1.4 CIMT测量 所有病人入院第2天行颈动脉超声检查，用荷兰飞利浦HD-15型彩色多普勒超声诊断仪测定CIMT，由同一位有经验的B超医师进行操作，病人去枕颈后仰，头偏向一侧。用9 MHz探头分别检测双侧颈总动脉、颈总动脉分叉部、颈内动脉颅外段及颈外动脉的CIMT，超声测量指标包括：CIMT、斑块硬化范围、内径狭窄情况[7]。颈动脉粥样硬化诊断标准[8]：①CIMT<0.9 mm表示颈动脉超声阴性；②CIMT≥0.9 mm表示颈动脉超声阳性；CIMT>0.9 mm，且≤1.3 mm表示CIMT增厚；CIMT>1.3 mm表示颈动脉斑块形成。根据CIMT和颈动脉内斑块回声特性，将急性脑梗死病人分为无斑块组(31例)、稳定斑块组(42例)和不稳定斑块组(52例)。依据半定量法估计斑块严重程度：单侧斑块≤2.1 mm定义为Ⅰ级；单侧斑块>2.1 mm或双侧均有斑块且至少一侧斑块≤2.1 mm定义为Ⅱ级；双侧斑块>2.1 mm定义为Ⅲ级。其中，Ⅰ级20例，Ⅱ级41例，Ⅲ级33例。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 两组性别、年龄、BMI、心率、收缩压、舒张压、吸烟史、合并高血压、糖尿病、冠心病、血清HDL-C、TC、TG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，研究组血清LDL-C水平较高(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 急性脑梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平比较 与无斑块组相比，不稳定斑块组、稳定斑块组PBMCs中Cx43 mRNA水平较高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平较低(P<0.05)；与稳定斑块组相比，不稳定斑块组PBMCs中Cx43 mRNA水平较高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平较低(P<0.05)。详见表2。

表2 急性脑梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平比较(±s)

2.3 不同等级粥样硬化斑块与PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平的关系 与Ⅰ级组相比，Ⅱ级组、Ⅲ级组PBMCs中Cx43 mRNA水平较高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平较低(P<0.05)；与Ⅱ级组相比，Ⅲ级组PBMCs中Cx43 mRNA水平较高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平较低(P<0.05)。详见表3。

表3 不同等级粥样硬化斑块与PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平的关系(±s)

2.4 急性脑梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平与CIMT的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，急性脑梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA水平与CIMT呈正相关(r=0.543，P<0.05)；PBMCs中PPARγ mRNA水平与CIMT呈负相关(r=-0.509，P<0.05)。

2.5 影响急性脑梗死病人CIMT的多因素Logistic回归分析 以急性脑梗死病人CIMT为因变量，Logistic回归分析显示，Cx43高表达、PPARγ低表达是影响急性脑梗死病人CIMT增厚的独立危险因素(P<0.05)。详见表4。

表4 影响急性脑梗死病人CIMT增厚的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

急性脑梗死大部分是由不稳定斑块破裂导致。动脉粥样硬化斑块破裂后局部形成血栓，阻塞血管，导致脑组织缺血缺氧，从而发生急性脑梗死[9]。有文献报道PBMCs可黏附血管内皮细胞，被多种因素驱使进入血管内膜，然后在血管内膜处被激活，分化为巨噬细胞，吞噬脂质，导致粥样硬化斑块形成；另外，随着斑块厚度增加，导致动脉血流减少，或者斑块破裂，均可导致急性脑梗死发生[10]。故本研究探索PBMCs中因子水平变化。颈动脉是全身动脉粥样硬化的窗口，颈动脉超声是评价颈动脉粥样硬化的常用方法，可检测CIMT、颈动脉狭窄以及斑块内部成分。

Cx43属于间隙连接蛋白家族，是重要的间隙连接蛋白，对调节干细胞的分化至关重要，其特异性表达与心脑血管疾病的发生、发展息息相关。国外研究发现，阻断Cx43表达可抑制间隙连接蛋白介导的相邻细胞之间的信号传递，从而降低血管内皮细胞的增殖、迁移和减少血管损伤后新内膜的形成[11]。朱建等[12]研究显示，不稳定型心绞痛病人PBMCs中Cx43明显高于健康对照者。本研究发现，无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组PBMCs中Cx43 mRNA水平依次明显升高，提示Cx43可能与颈动脉粥样硬化斑块的发生有关。Cx43在PBMCs黏附血管内皮细胞这一过程中起着关键作用。另外，有研究显示Cx43高表达促进PBMCs进入血管内膜，且在PBMCs分化为巨噬细胞进程中，Cx43高表达加快了脂质被吞噬的速度，促进动脉粥样硬化发生[13]。本研究发现，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级粥样斑块病人PBMCs中Cx43 mRNA水平依次升高，提示Cx43可能与颈动脉斑块的发展进程有关。推测Cx43可能通过影响PBMCs从而影响病人动脉粥样硬化发生。进一步研究发现，急性脑梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA水平与CIMT呈正相关，经Logistic回归分析证实，Cx43高表达是急性脑梗死CIMT增厚的独立危险因素，提示Cx43是颈动脉粥样硬化发生的相关因素，Cx43浓度升高可能促使颈动脉粥样硬化发生。

动脉粥样硬化是动态发展过程，其发生原因与动脉内皮细胞的炎症反应有关。PPARγ属于核受体超家族成员，PPARγ基因有两个PPARγ1和PPARγ2亚型，是配体激活转录因子，PPARγ在血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞中均有表达，可调节炎症相关的多种生物学功能。另外，有文献报道内皮细胞中PPARγ高表达可防止血栓形成，PPARγ激活可通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)的激活，下调促炎细胞黏附分子的表达，并增强内皮一氧化氮的产生，防止血栓形成[14]。本研究发现，无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组PBMCs中PPARγ mRNA水平依次降低，提示PPARγ可能与颈动脉粥样硬化斑块形成有关。Liu等[15]研究发现，PPARγ高表达可减轻血管内皮损伤。本研究发现，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级粥样斑块病人PBMCs中PPARγ mRNA水平依次降低，提示PPARγ可能影响颈动脉粥样硬化斑块发展进程。推测PPARγ可能通过调控炎症相关信号通路调控血管内皮细胞，从而调控粥样硬化斑块，PPARγ在颈动脉粥样硬化斑块中可能为保护因素，但PPARγ不足以阻止粥样硬化斑块发生。进一步研究发现，急性脑梗死病人PBMCs 中PPARγ水平与CIMT呈负相关，经Logistic回归分析证实，PPARγ低表达是急性脑梗死病人CIMT增厚的独立危险因素，提示PPARγ是颈动脉粥样硬化发生的相关因素，PPARγ浓度降低可能促使颈动脉粥样硬化发生。

综上所述，急性脑梗死病人PBMCs中Cx43水平与颈动脉粥样硬化呈正相关，PPARγ水平与颈动脉粥样硬化呈负相关性，Cx43、PPARγ是急性脑梗死病人颈动脉粥样硬化的影响因素，本研究探索了Cx43、PPARγ与颈动脉粥样硬化的关系，为临床上阐明急性脑梗死病人颈动脉粥样硬化发生机制奠定了基础，但PBMCs中Cx43、PPARγ与颈动脉粥样硬化发生的作用机制尚未明确，仍需进一步深入研究。