TBHQ对鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织细胞焦亡、坏死和炎症损伤的影响

郗蒙雪，沈丹，石一凡，李春梅

南京农业大学动物科技学院，家畜环境控制与智慧生产研究中心，南京 210095

0 引言

【研究意义】我国畜禽养殖业主要以集约化、封闭式为主，在带来可观经济效益的同时，也出现了不少亟待解决的问题[1]。鸡舍内空气污染问题是近些年来养殖人员和科研人员关注的焦点。鸡舍空气细颗粒物（fine particles matters, PM2.5）是影响舍内空气质量的主要因素之一[2]，其污染严重、成分复杂、毒性大，易诱发鸡呼吸道炎症，成为健康养鸡生产的巨大风险因素[3]。因此，阐明鸡舍细颗粒物引起的鸡肺炎症损伤及缓解作用机制对于安全高效养鸡生产具有重要意义。【前人研究进展】前期研究表明，鸡舍内空气PM2.5不仅浓度高，而且含有多种重金属离子和内毒素，并携带多种有害细菌和真菌[4]。另外，进一步研究发现鸡舍PM2.5可诱发肺泡上皮细胞氧化损伤并产生炎症反应[5]。饲料添加剂特丁基对苯二酚（tert-Butylhydroquinone, TBHQ）具有抗氧化[6]和抗炎[7]双重功效，能够诱导细胞产生并释放抗氧化酶，清除过多的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS），保护机体免受氧化应激的损伤[8-10]。【本研究切入点】目前有关TBHQ对PM2.5诱导鸡肺损伤的缓解作用研究尚未见报道。鸡胚作为毒理学领域的经典研究模型，具有血管网丰富且发育迅速、线粒体含量多等特点，常用于抗炎、抗应激等方面作用的研究，是十分成熟的氧化应激模型[11-12]。此外，鸡胚与细胞相比更接近于机体的生长环境，与机体直接暴露PM2.5相比更容易精准把控染毒剂量，是 PM2.5毒性作用研究的成熟模型[13]。【拟解决的关键问题】本试验以鸡胚为试验对象，通过建立鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织损伤模型，探讨 TBHQ的缓解作用及相关机制，为预防或缓解鸡舍PM2.5污染引起的鸡呼吸道健康问题提供理论依据和解决对策。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年5月至2020年12月在南京农业大学动物科技学院家畜环境控制与智慧生产研究中心完成。

SPF鸡胚，购自江苏省南京市特有机有限公司；总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）（是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（是生物体内脂质过氧化反应终产物，常用来反映机体氧化程度）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）（反映机体各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平）试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；RNA isolater试剂购自 Invitrogen公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司；鸡舍PM2.5，采集于江苏省某标准集约化养鸡场。

1.2 主要仪器

大气颗粒物采样器（BTPM-HS1）购自丹东百特生物仪器有限公司；酶标仪、涡旋仪购自 Thermo公司；超声波震荡仪购自江苏省昆山市超声波仪器有限公司；梯度PCR热循环仪购自TaKaRa公司；光学显微镜（Nikon YS100）购自Nikon公司；荧光定量PCR仪购自ABI SteoOnePlus公司。

1.3 试验设计

1.3.1 PM2.5诱导鸡胚肺损伤模型的建立 将PM2.5储备液（1 mg·mL-1）用生理盐水稀释终浓度为0、0.25、0.5、1 mg·mL-1。14日龄鸡胚的小头端酒精消毒后打孔，1 mL注射器垂直注入鸡胚卵白处，进针长度约1 cm，每只鸡胚注射50 μL，每个浓度的试剂注射5个鸡胚，重复3次试验。孵化箱温度设定为37.5 ℃，湿度设定为68%，连续孵育5 d，每天观察鸡胚存活情况并记录。

1.3.2 TBHQ对PM2.5诱导鸡胚肺损伤的缓解试验 据上述试验结果，选取浓度为 0.25 mg·mL-1PM2.5以及0.1 μg·mL-1TBHQ（根据课题组前期研究结果）进行后续试验。60只14日龄鸡胚随机分为4组（15只鸡胚/组）：对照组（100 μL生理盐水）、TBHQ组（100 μL 0.1 μg·mL-1TBHQ）、PM2.5组（100 μL 0.25 mg·mL-1PM2.5）以及 PM2.5和 TBHQ 组（50 μL 0.25 mg·mL-1PM2.5+ 50 μL 0.1 μg·mL-1TBHQ）。操作步骤同 1.3.1。

1.3.3 样品采集 鸡胚孵育至19日龄，采集肺组织样本，记录蛋重、胚胎重以及肺组织重量并及时整理。

1.4 试验方法

1.4.1 PM2.5的收集 将大气颗粒采样器（BTPMHS1）放置鸡舍中央，采样器流量为16.67 L·min-1，采样时间为2019年6月早7:00到晚22:00，连续采样30 d。

1.4.2 PM2.5的提取 根据文献[5]的方法，将采集有PM2.5的石英膜用塑料剪刀剪成约1 cm×3 cm大小，放置盛有去离子水的100 mL烧杯中。超声波震荡仪调至80 Hz，将烧杯放入其中，震荡15 min后用塑料小镊子取出石英膜，将悬浊液用六层纱布过滤至锥形瓶中。过滤完成的悬浊液分装至离心管中，将其放入离心机中，4 ℃、12 000 ×g离心30 min。弃去上清，留约0.5 mL的液体，将其放置真空冷冻干燥仪中干燥过夜。干燥完毕的离心管放置干燥器中干燥6 h后，用生理盐水重新溶解颗粒物，将其制成1 mg·mL-1母液，灭菌后放置4 ℃备用。

1.4.3 鸡胚肺组织切片 肺组织在4%多聚甲醛中固定。固定好后，用不同浓度的酒精进行脱水处理。脱水完毕后，依次进行透明处理，组织透蜡。修整制作好的蜡块，放入石蜡切片机中切片，切片厚度设定为5 μm。苏木素和伊红染色后封片，虚拟显微镜下观察切片。

1.4.4 鸡胚肺组织中氧化应激参数测定 取约0.2 g组织，预冷的生理盐水冲洗去掉血液，滤纸擦干后放入烧杯，加入组织重量9倍的生理盐水，匀浆后离心，吸取上清，制备10%组织匀浆液。取适量匀浆液，按照T-SOD、MDA、T-AOC试剂盒说明书中详细步骤进行操作，酶标仪检测吸光值，记录并计算。

1.4.5 实时荧光定量PCR 取约20 mg组织放入离心管，加1 mL RNA isolater，裂解组织。4 ℃ 12 000×g离心15 min后，取上清，加入等体积的异丙醇，4 ℃静置10 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃上清，加入75%乙醇轻轻洗涤，4 ℃ 12 000×g离心5 min，弃上清，放入通风橱晾干。约30 min后，加入DEPC水，溶解沉淀。从NCBI上获取目的基因的核酸序列，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

测得总RNA浓度后，依据反转录说明书严格执行。调整cDNA浓度进行扩增。反应总体系为20 μL：2×T 5 Fast qPCR Mix 10 μL，上下游引物均为0.8 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反应程序为95 ℃反应1 min，循环次数为1次；95 ℃反应10 s，循环40次；60 ℃反应10—15 s，循环40次。反应结束后，观察溶解曲线判断可行性。

1.5 数据统计与分析

试验数据用平均数±标准误（Mean±SEM）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，采用GraphPad Prism 6.0软件完成数据分析。

2 结果

2.1 PM2.5诱导鸡胚肺损伤模型的建立

2.1.1 PM2.5对鸡胚存活率的影响 如表2所示，对照组与浓度为0.25、0.5、1 mg·mL-1的PM2.5各组中鸡胚均未出现死亡现象。

表2 不同浓度PM2.5对鸡胚存活率的影响Table 2 Effects of different concentrations of PM2.5 on the survival rate of chick embryos

2.1.2 PM2.5对鸡胚肺组织的形态影响 如图1所示，与对照组相比，0.25 mg·mL-1PM2.5组的鸡胚肺泡中可见浸润的少量炎症细胞，而0.5、1 mg·mL-1PM2.5组的鸡胚肺泡中出现严重的肺水肿现象。因此，选取PM2.5浓度为0.25 mg·mL-1进行后续的研究。

图1 不同浓度PM2.5对鸡胚肺组织形态的影响Fig.1 Effects of different concentrations of PM2.5 on the morphology of chick embryo lungs

2.2 TBHQ对PM2.5诱导鸡胚肺组织损伤的影响

2.2.1 TBHQ或PM2.5对鸡胚胚胎重量、肺组织重量及相关指数的影响 由表3可知，在各组蛋重无显著差异条件下，PM2.5或 TBHQ各组的鸡胚胚胎重量、肺组织重量、胚蛋比以及肺胚比与对照组相比均无显著差异。

表3 TBHQ或PM2.5对鸡胚胚胎重量、肺组织重量及相关指数的影响Table 3 Effects of TBHQ or PM2.5 on embryo weight, lung tissue weight and related indexes of chick embryos

2.2.2 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织形态的影响 如图2所示，与对照组相比，TBHQ组的鸡胚肺组织形态无明显变化，PM2.5组肺泡中有炎症细胞浸润，PM2.5和 TBHQ共处理组的肺泡中可见少量的炎症细胞。

图2 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织形态的影响Fig.2 Effects of TBHQ on the morphology of chick embryo lungs damage induced by PM2.5

2.2.3 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织氧化应激参数的影响 如图3所示，与对照组相比，各组的鸡胚肺组织中MDA浓度，T-AOC水平以及T-SOD活性均无显著性变化。然而，PM2.5和TBHQ共处理组与PM2.5组相比，MDA浓度具有下降趋势。

图3 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织氧化应激参数的影响Fig.3 Effects of TBHQ on oxidative stress parameters of lung tissue after PM2.5-induced lung injury in chick embryos

2.2.4 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织细胞焦亡和细胞程序性坏死相关基因表达的影响 由表 4可知，与PM2.5组相比，PM2.5和TBHQ共处理组的IL-18、IL-1β、RIPK1、MLKL表达显著下降，而RIPK3表达显著上升，NLRP3表达水平无明显变化，各组的Caspase-1表达水平与对照组相比均显著上调。

表4 TBHQ对PM2.5处理鸡胚肺组织细胞焦亡和细胞程序性坏死相关基因表达的影响Table 4 Effects of TBHQ on the expression of pyroptosis and necroptosis related genes in lung tissues after PM2.5- induced lung injury in chick embryos

3 讨论

3.1 鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织产生炎症反应

外部刺激对细胞产生不利影响，可导致机体稳态失衡。在本研究中，PM2.5虽对鸡胚存活率无影响，但对鸡胚肺组织造成了不同程度的炎症损伤，出现了炎性细胞浸润和肺水肿现象。相似地，大气颗粒物、香烟烟雾颗粒物、汽车尾气颗粒物等会导致实验动物呼吸系统淋巴细胞、肥大细胞聚集和中性粒细胞浸润，产生炎症反应[14-16]。原因可能是颗粒物的刺激激活了相关的炎症因子和一系列相关的编码转录因子[17-18]。

3.2 TBHQ对PM2.5诱导鸡胚肺损伤的缓解作用

细胞焦亡和细胞程序性坏死是基因编码的两种细胞死亡方式，可保护宿主免受微生物病原体的危害，参与多种肺部疾病的发生与发展，并伴随炎症因子的释放[19-20]。在本试验中，PM2.5上调了鸡胚肺组织中细胞焦亡（NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18）和细胞程序性坏死相关基因（RIPK1、RIPK3、MLKL）的表达，说明 PM2.5可通过细胞焦亡和细胞程序性坏死两条途径导致鸡肺炎症损伤。TBHQ具有高效抗氧化性，但其浓度较高时可能具有一定的致毒作用[21-22]。在本试验中，TBHQ诱导Caspase-1和RIPK3基因上调，而且，与PM2.5单独暴露相比，PM2.5和TBHQ共同处理显著上调鸡胚肺组织中Caspase-1和RIPK3表达。这可能是因为TBHQ能够诱导线粒体膜电位下降，线粒体结构破坏，形成细胞质空泡，线粒体释放细胞色素 c，激活 Caspase，诱导细胞坏死相关基因RIPK3表达水平上升[23]。相反，TBHQ可显著降低 PM2.5诱导的鸡胚肺组织中IL-1β、IL-18、RIPK1、MLKL的表达，且对 PM2.5诱导的肺组织中炎性细胞浸润现象具有一定的缓解作用，但TBHQ无法完全治愈肺组织中炎性浸润现象，可能和选择的TBHQ浓度相关，需要进一步试验验证。这些结果说明TBHQ能够通过抑制PM2.5诱导的鸡胚肺组织细胞焦亡和细胞程序性坏死的发生减缓炎症反应，保护鸡肺组织结构和功能的完整性。

MDA是氧化应激过程中产生脂质过氧化反应的终产物，反映机体氧化损伤程度。在氧化应激过程中，机体遭受刺激产生ROS或活性氮自由基，氧化与抗氧化失衡，引起多种反应[24-25]。ROS可损坏脂质，导致脂质过氧化[26-27]，产生大量MDA，参与多种方式的细胞死亡。最近研究发现，紫茎泽兰可通过 ROS-NLRP3通路介导细胞焦亡，诱导小鼠肝毒性[28]。在小鼠胚胎成纤维细胞中，线粒体ROS促进RIPK1的自磷酸化，诱导RIPK3招募到坏死体，发生细胞程序性坏死[29]。在本试验中，TBHQ降低了PM2.5诱导的鸡胚肺组织中MDA浓度，推测这可能是由于TBHQ可特异性激活Nrf2，引起下游抗氧化酶的合成与释放，清除ROS，减少脂质过氧化反应[30]，降低 MDA浓度，从而减少细胞焦亡和细胞程序性坏死的发生。因此，推测 ROS介导了鸡舍PM2.5引起的鸡胚肺组织细胞焦亡和细胞程序性坏死，而TBHQ能够通过清除ROS缓解鸡舍PM2.5诱导的鸡胚肺损伤。

4 结论

本试验成功建立了鸡舍 PM2.5诱导的鸡胚肺损伤模型，并利用该模型研究发现，TBHQ能够通过抗氧化途径降低鸡胚肺组织细胞焦亡和细胞程序性坏死的发生，缓解由鸡舍 PM2.5引起的鸡胚肺组织炎症损伤。