白头翁皂苷 B4对犊牛生长性能、消化代谢和瘤胃发酵的影响

卢猛，胡凤明，屠焰，刁其玉

中国农业科学院饲料研究所/农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081

0 引言

【研究意义】从出生到60日龄是犊牛生长发育的关键时期，也是其营养调控的“窗口期”，在此阶段，犊牛需要经历由无菌到有菌、被动免疫到主动免疫、从皱胃消化过渡到瘤胃消化以及由化学消化过渡到微生物消化的转变[1]。新生犊牛由于各项机能未发育完全，容易受到各种病原菌的侵扰发生疾病和死亡，其中腹泻是导致哺乳期犊牛死亡的最主要原因[2]。根据美国2018年国家动物健康监控系统统计，犊牛生后前3周的腹泻引起的死亡率高达 39%[3]，这主要与动物机体胃肠道消化系统的建立不完全有关。抗生素是过去数十年保障动物健康和促进动物生长的常用药，但是长期使用会使机体内滋生超级细菌，降低有益菌的数量，增加疾病风险[4]。同时抗生素具有残留性，容易危害人类健康。近年来，随着科技的进步和生活水平的提高，人们开始追求健康、绿色和安全的食品。根据农业农村部194号公告显示，我国饲料行业已经进入无抗时代，因此当下的研究热点是寻找一种新型且无毒副作用的替抗产品。植物提取物是植物的次生代谢物[5]，具有抗菌、抗炎的功能[6-7]，随着一些国家对离子载体饲料添加剂的禁止，植物提取物被提出作为化学饲料添加剂的替代品。白头翁来源于毛茛科白头翁（Pulsatilla Chinensis Regel）的干根，在我国生长已有数千年的历史，在抗菌、抗炎、增强免疫等方面发挥着重要作用[8-9]。白头翁皂苷B4是白头翁中含量最高的单体成分，也是其抗炎、抗肿瘤生物学活性的基础，具有抗菌、抗炎作用[10]。【前人研究进展】体外抗菌试验表明，白头翁皂苷 B4能抑制大肠杆菌等病原菌的生长[11]。同时，白头翁皂苷 B4可以抑制LPS诱导的小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子的表达，增强机体的抗炎能力[12]。另外，有研究证明，给临床型乳房炎奶牛连续4—6d颈部肌肉注射30 mL白头翁皂苷 B4可以达到理想的治疗效果，治愈率可到75.00%，且无明显的临床副作用[13]。【本研究切入点】基于前人对白头翁皂苷 B4进行了一定的研究，但是这些研究主要集中体外的抑菌效果，在动物上的应用也局限于小鼠和奶牛，有关白头翁皂苷 B4在犊牛上的作用效果还未见报道。【拟解决的关键问题】通过在犊牛代乳品中添加白头翁皂苷B4，研究不同添加水平的白头翁皂苷 B4对犊牛生长性能和消化代谢以及瘤胃发酵参数的影响，为白头翁皂苷 B4在犊牛培育中的应用提供数据支撑，也为新型饲料添加剂的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白头翁皂苷 B4（C59H96O26，相对分子质量为1 221.39），纯度为67.41%，购自南京春秋生物工程有限公司。

1.2 试验动物与试验饲粮

本研究于2020年10月至2021年5月在中国农业科学院南口中试基地进行。选取60头健康的新生荷斯坦牛公犊，犊牛采食的代乳粉由北京精准动物营养研究中心有限公司提供，代乳粉按照国家发明专利 CN 02128844.5进行配制，其营养水平见表1，开食料购自天津联英饲料有限公司，开食料组成及其营养水平见表2。

表1 代乳粉的营养水平（风干物质基础）Table 1 Nutrient levels of milk replacers (air-dry basis)

表2 开食料的组成及营养水平（风干物质基础）Table 2 Composition and nutrient levels of the starter (air-dry basis)

1.3 试验设计与饲养管理

试验选择 60头健康的新生荷斯坦奶公犊牛进行试验（体重为43.7±3.9 kg；血清总蛋白浓度大于55g·L-1），按照体重相近的原则随机分为4组，每组15头，分别饲喂0（C组）、15（A1组）、30（A2组）、45（A3组）mg·d-1的白头翁皂苷B4。试验每头犊牛总共摄入6L初乳，其中4L在出生后2h内饲喂，其余2L在第一次饲喂后8h再次进行饲喂。

代乳粉按犊牛体重的 1.25%（干物质基础）进行饲喂，30日龄前，每日3次（08:00、13:00、18:00）饲喂代乳粉，30日龄之后转为两次（08:00、17:00）饲喂。在犊牛3日龄时补饲开食料，14日龄开始每日详细记录投喂量和剩料量，计算采食量。试验过程中，开食料和水自由采食。

1.4 样品采集与测定

1.4.1 饲料样品采集与测定 每两周采集一次试验代乳粉和开食料样品，4℃保存。试验结束后混匀样品并带回实验室，参照AOAC（2000）[14]测定日粮的营养成分，其中粗蛋白质（CP）用Ketuo KDY-9830 凯氏定氮仪测定、NDF和ADF的含量采用ANKOM 200 Fiber Analyzer测定、粗脂肪（EE）含量采用ANKOM-XT15i 全自动脂肪分析仪测定、总能（GE）以PARR-6400全自动氧弹量热仪测定。

1.4.2 生长性能 分别在犊牛 14、28、42 和 56 日龄晨饲前进行体重测定。每日详细记录代乳粉和开食料的饲喂量和剩料量，计算采食量（dry matter intake，DMI）、日增重（average daily gain，ADG）和饲料转化比（feed conversion rate，F/G）。

1.4.3 腹泻率 每天观察犊牛的健康状况，并对粪便进行四分制评分。粪便评分标准见表 3[15]。当动物连续2 d粪便评分≥3分，即为腹泻，腹泻发生率计算如下：腹泻发生率（%）= 腹泻犊牛总头数×100 /（试验组犊牛数量×试验天数）。

表3 粪便评分标准Table 3 Fecal score standard

1.4.4 瘤胃液样品采集与测定 分别于犊牛28、42、56日龄晨饲后2 h通过口腔采集瘤胃液，立即用便携式pH计（Testo-206-pH2）测定瘤胃液pH，然后分装于 10 mL灭菌离心管中，-20℃冷冻保存待测。其中VFA浓度用气相色谱法[16]测定；NH3-N浓度采用苯酚-次氯酸钠比色法[17]测定；MCP浓度使用考马斯亮蓝法[18]测定。

1.4.5 消化代谢试验样品采集与测定 动物饲养试验过程中，分别在犊牛42日龄和63日龄，每个处理组随机选择6头健康且体重相近的犊牛，以全收粪尿法进行两期消化代谢试验，每期7 d，其中预饲期4 d，正式期3 d。详细记录每头犊牛每日实际采食量、排粪量和排尿量。每日采集粪便总量的10%作为混合样品，然后每100 g鲜粪加入10%的稀硫酸10 mL固氮。连续收集每头牛日排尿量的 1%作为混合样品，用 10%的稀硫酸调整尿样pH。收集的粪、尿样品于-20 ℃冷冻保存，待测。营养物质表观消化率和能氮代谢指标的计算方法参照《动物营养学》[19]。

1.5 统计分析

使用Excel 2017对原始数据进行初步的整理。采用SPSS 26.0软件中的单因素方差分析程序（one-way ANOVA）对哺乳期犊牛体重、日增重、干物质采食量、饲料转化比、粪便评分、腹泻率、断奶前后的营养物质表观消化率、能量代谢指标和氮代谢指标、瘤胃发酵参数指标进行分析，差异显著时用LSD氏法进行多重比较，当P＜0.05时，表示差异显著，当0.05≤P＜0.10时，表示为有提高或降低的趋势。

2 结果

2.1 生长性能

表4为白头翁皂苷B4对犊牛生长性能的影响。从中可以看出，哺乳期犊牛体重和干物质采食量不受白头翁皂苷 B4的影响（P＞0.05），C组、A1、A2和 A3组犊牛全期体重的增长率在数值上逐渐升高，但无显著的剂量效应（P＞0.05）；犊牛14—28日龄的平均日增重和饲料转化比与白头翁皂苷 B4的添加量之间存在显著剂量相关性（P＜0.05），其中，平均日增重随白头翁皂苷B4添加量的增加显著增加（P＜0.05），饲料转化比呈相反的结果（P＜0.05）。通过线性和二次曲线P值可以看出，A3组的效果最佳。

表4 白头翁皂苷B4对犊牛体重、平均日增重、干物质采食量和饲料转化比的影响Table 4 Effects of Anemoside B4 on Body weight, ADG, DMI and FCR of suckling calves

2.2 腹泻率

由表 5可知，粪便评分和腹泻率具有一致的规律。7—56日龄和7—14日龄时，A3犊牛的粪便评分和腹泻率均显著低于C组（P＜0.05），与添加剂量呈显著负相关（P＜0.05）；15—28日龄时，A2犊牛的粪便评分和腹泻率均显著低于 C组（P＜0.05），随着添加剂量的增加显著降低（P＜0.05），其余各组之间差异不显著（P＞0.05）；29—42日龄和43—56日龄时，各组犊牛的粪便评分和腹泻率差异不显著（P＞0.05）。

表5 白头翁皂苷B4对犊牛粪便评分和腹泻率的影响Table 5 Effects of Anemoside B4 on fecal score and diarrhea incidence of suckling calves

2.3 营养物质消化率

从表6可以看出，断奶前期，A3组犊牛干物质采食量显著低于C组（P＜0.05），A2组犊牛干物质采食量有显著低于C组的趋势（0.05≤P＜0.10），犊牛的干物质采食量随白头翁皂苷 B4添加量的增加显著降低（P＜0.05）；与C组相比，A1、A2、A3组犊牛干物质、粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率差异不显著（P＞0.05），但从整体来看逐渐增加，但与白头翁皂苷 B4的添加量无显著相关性（P＞0.05）。断奶后期，A1、A2、A3组犊牛干物质采食量逐渐增加，与C组差异不显著（P＞0.05），且与白头翁皂苷B4的添加量无显著相关性（P＞0.05）；A2组干物质和中性洗涤纤维的表观消化率有显著高于A1组的趋势（0.05≤P＜0.10），酸性洗涤纤维的表观消化率显著高于A1组（P＜0.05），但与C、A3组差异不显著（P＞0.05）。通过线性和二次曲线P值可以看出，断奶前，A3组犊牛营养物质消化效果最佳，断奶后，A2组犊牛营养物质消化效果最佳。

表6 白头翁皂苷B4对哺乳期犊牛营养物质消化率的影响Table 6 Effects of Anemoside B4 on nutrient apparent digestibility of suckling calves

2.4 能氮代谢

由表7可知，在断奶前，与C组相比，A1、A2和 A3组犊牛的粪能、尿能、总能消化率、总能代谢率和消化能代谢率没有显著差异（P＞0.05），但 C组犊牛摄入总能显著高于A3组（P＜0.05），有显著高于A2组的趋势（0.05≤P＜0.10），此外，A1组犊牛摄入总能显著高于 A3组（P＜0.05）。断奶后，C组粪能有高于A2组的趋势（0.05≤P＜0.10），A2组总能消化率有高于A1组的趋势（0.05≤P＜0.10），A2组总能代谢率高于A1组（P＜0.05）,且有高于C组的趋势（0.05≤P＜0.10）。摄入总能、尿能和消化能代谢率在各组间差异不显著（P＞0.05）。从表8可以看出，断奶前，各组间粪氮、尿氮、氮消化率和氮沉积率差异不显著（P＞0.05），C组摄入总氮显著高于A3组（P＜0.05）。断奶后，各组之间氮代谢指标差异不显著（P＞0.05），A2、A3组粪氮和尿氮低于C组，氮消化率和沉积率高于C组。通过线性和二次曲线P值可以看出，断奶前，A3组犊牛能量和氮代谢优于其他组，断奶后，A2组犊牛效果最优。

表7 白头翁皂苷B4对哺乳期犊牛能量代谢的影响Table 7 Effects of Anemoside B4 on energy metabolism of suckling calves

表8 白头翁皂苷B4对哺乳期犊牛氮代谢的影响Table 8 Effects of Anemoside B4 on nitrogen metabolism of suckling calves

2.5 瘤胃发酵参数

从表9可知，白头翁皂苷B4对犊牛瘤胃液pH和总挥发性脂肪酸含量没有显著影响（P＞0.05），对瘤胃挥发性脂肪酸中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的摩尔比和乙酸/丙酸，以及氨态氮浓度和微生物蛋白含量皆无显著影响（P＞0.05），各指标与白头翁皂苷B4的添加剂量无显著相关性（P＞0.05）。各瘤胃发酵参数均处于正常值范围。

表9 白头翁皂苷B4对哺乳期犊牛瘤胃发酵参数的影响Table 9 Effects of Anemoside B4 on rumen fluid fermentation parameters of suckling calves

3 讨论

3.1 白头翁皂苷B4对犊牛生长性能和腹泻的影响

生长性能的高低是反映犊牛生长发育好坏的重要指标。在本研究中，45 mg·d-1的白头翁皂苷B4显著增加了犊牛14—28日龄犊牛的平均日增重，在采食量无显著差异的条件下，饲料转化效率得到显著提升，表明白头翁皂苷 B4能促进犊牛对营养物质的消化吸收，供给机体更多的能量，有效促进犊牛生长，获得更大的经济效益，同时有效降低犊牛因消化不良引起的腹泻发生率[20]。有调查显示[21]，断奶前犊牛发病率为14.1%，死亡率为3.5%，其中消化系统疾病（腹泻、脱水）占46.8%，此项报告包含了京津冀地区的9.41万头奶牛，其中犊牛8 295头，占牛群结构的13%。由此可见，腹泻是哺乳期犊牛的主要疾病，严重影响着牧场的发展，而致病性大肠杆菌和沙门氏菌是引起犊牛腹泻的主要病原菌，体外研究表明，白头翁皂苷B4具有显著的抑菌效果[11]。研究发现，12.5 mg·kg-1的白头翁皂苷可以达到与抗生素一致的效果，在一定程度上可以有效替代抗生素[22]，0.05 mL/kg·d-1的白头翁皂苷 B4对临床型泌乳奶牛乳房炎的治愈率高达75%[13]。在本研究中，未添加白头翁皂苷 B4的犊牛腹泻率高达36.27%，而45 mg·d-1的白头翁皂苷B4显著降低了哺乳期犊牛32.37%，尤其对28日龄前的腹泻率具有显著效果，其机制可能是白头翁皂苷 B4对致病性大肠杆菌具有较强的抑制作用，这与前人的研究结果一致[23]。28日龄之后，各处理组的腹泻率间未出现显著差异，这主要是因为犊牛自身免疫系统的逐渐健全和肠道菌群的逐渐趋于稳定，能够有效抵御外界病原菌的侵袭，同时也说明白头翁皂苷 B4对犊牛腹泻的防治效果随着日龄的增加逐渐降低，其作用主要体现在犊牛28日龄前。根据线性和二次曲线的显著性P值可以看出，作用效果与添加剂量具有一定的正相关性，其中45 mg·d-1的白头翁皂苷B4效果最佳，但未达到剂量最佳值，表明白头翁皂苷 B4的添加剂量还有研究的可能，这也是日后研究的方向之一。

3.2 白头翁皂苷 B4对犊牛营养物质表观消化率的影响

动物对饲粮中营养物质的利用率的高低可以反映其胃肠道发育的好坏，直接影响幼龄动物的培育效果。皂苷类物质是一种重要的植物次生代谢产物，对动物消化率可能具有一定的影响，但是未有统一的结果。消化酶是哺乳期犊牛对营养物质消化的主要方式，本研究中，白头翁皂苷 B4没有显著提高犊牛对各营养物质的表观消化率，但与未添加白头翁皂苷B4相比，45 mg·d-1的白头翁皂苷B4分别提高了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率 35.78%和 40.38%，这可能是因为白头翁皂苷 B4皂苷提高了哺乳期犊牛肠道内纤维分解菌和纤维素酶的活性[24]，加快了纤维素的分解，表明白头翁皂苷 B4在一定程度上可提高机体的消化能力。断奶后，营养物质的消化率与添加剂量未呈现出显著的相关性，这可能是因为随着日龄的增加，白头翁皂苷 B4对机体的调控作用逐渐降低，但30 mg·d-1的白头翁皂苷B4分别提高了粗蛋白、粗脂肪消化率 24.52%和 41.86%，这可能与瘤胃内氨态氮含量的降低有关，氨态氮含量的降低可提高机体对饲粮蛋白质和碳水化合物的消化能力[25]。另外，30 mg·d-1的白头翁皂苷 B4分别提高了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率 26.23%和 39.26%，纤维素消化率的增加，可以引起了机体饱腹感，使干物质的采食量有效下降，这有助于减少饲料成本的投入，增加养殖效益。ZHOU等[26]在山羊日粮中添加不同剂量的茶皂素，结果显示，添加茶皂素对山羊营养物质消化率以及瘤胃发酵模式均没有产生显著影响，这与本研究的结果相一致。刘策通过在羔羊日粮中添加苜蓿皂苷发现，苜蓿皂苷对羔羊干物质、粗蛋白和酸性洗涤纤维的表观消化率具有显著的提升作用[25]，王世琴等[27]给早期断奶羔羊饲喂地衣芽孢杆菌和白藜芦醇发现，两种添加剂未能有效提高羔羊对营养物质消化代谢，同时对羔羊断奶前后的采食量和日增重均无显著作用。表明，添加剂的种类与对营养物质的作用效果有关。此外，添加剂的作用效果还可能与动物的种类有关，关于白头翁皂苷 B4是否会对羔羊的营养物质的消化代谢产生影响需要进一步验证。

3.3 白头翁皂苷B4对犊牛能氮代谢的影响

犊牛采食饲粮后，食物中的蛋白质和碳水化合物及脂肪等营养物质在微生物的作用下逐渐转化为机体所能消化吸收且用于维持和生长需要的小分子物质。犊牛对能量和氮的吸收程度的高低直接关系到犊牛生长发育速度及其对营养物质消化代谢的能力，其摄入量又受到采食量的调控[28]。在本研究中，45 mg·d-1的白头翁皂苷 B4显著降低了犊牛断奶前的总能和总氮摄入量，这可能是因为皂苷类物质作为一种天然的糖基侧链，具有明显的苦味[29]，增加添加量会影响犊牛的采食量，犊牛日采食量下降，每日摄入的总能和总氮量也随之降低。断奶前各处理组能量代谢指标差异均不显著，30和45 mg·d-1的白头翁皂苷B4降低了粪能和尿能，提高了总能消化率、总能代谢率以及消化能代谢率。断奶后期，各处理组摄入总能、粪能、尿能和消化能代谢率没有显著差异，但30 mg·d-1的白头翁皂苷B4可以在一定程度上降低犊牛粪能和尿能值，提高总能消化率和代谢率，这些结果都表明犊牛对饲粮中能量的利用率在添加剂白头翁皂苷 B4的作用下有了一定程度的提高，营养物质的消化率也有不同程度的上调，犊牛生产力也因此得到了提高。犊牛对日粮中蛋白质的利用情况可由氮代谢指标反映，研究发现，饲粮中蛋白质水平越高，动物采食后的氮排放量也会显著升高[30]。植物提取物中含有皂苷、多糖、黄酮等有效成分，在改善动物肠道健康、提高营养物质利用率和氮代谢方面发挥重要作用。钟伟等[31]研究了不同水平的黄芪多糖对北极狐氮代谢及肠道形态结构的影响，结果发现，饲粮中添加黄芪多糖可以改善北极狐的肠道形态结构，增加其对蛋白质的利用率，但是对氮采食量、粪氮排出量、尿氮排出量以及氮沉积率均没有显著的影响。本研究中，添加白头翁皂苷B4可以显著增加断奶前犊牛的氮采食量，但是对断奶前后的其他氮代谢指标无显著影响，这与上述结果相一致，但是30 mg·d-1的白头翁皂苷B4分别提高了犊牛氮沉积率3.27%和33.57%，这说明白头翁皂苷B4在一定程度上加强了机体对蛋白质的利用率，但具体的调控机制还有待于深入研究。

3.4 白头翁皂苷B4对犊牛瘤胃发酵的影响

瘤胃是反刍动物良好的“发酵罐”，瘤胃中的微生物能够将食物中的难以消化的纤维素分解成为机体易于消化吸收的小分子物质，其发育程度与动物生产性能的高低直接挂钩。瘤胃pH、氨态氮和挥发性脂肪酸是反应瘤胃功能的重要指标，具有调节瘤胃内环境稳态、酸碱平衡等作用[32]。瘤胃液pH的高低可以反应出瘤胃的发酵状况，适宜的 pH是瘤胃正常发酵的前提。本研究中各组犊牛瘤胃液pH维持在5—6的范围内，低于正常值，其主要原因可能是添加皂苷后导致犊牛瘤胃原虫数量降低，使细菌数量相对增加，这与王洪荣等[33]研究发现一致。此外，低于较低的 pH可以促进瘤胃上皮吸收挥发性脂肪酸的速率，降低瘤胃挥发性脂肪酸的浓度，符合本研究结果。日粮中的碳水化合物在瘤胃内发酵产生挥发性脂肪酸，是反刍动物能量代谢过程中的重要来源，其可提供饲粮可消化能的60%[34]，在机体瘤胃上皮的增殖与生长方面发挥重要作用[35]。有研究报道，植物提取物可以改变犊牛瘤胃挥发性脂肪酸的组成和浓度，使瘤胃的发酵模式发生改变，影响瘤胃的生长发育[36]，但是只有少数的植物提取物具有提高瘤胃挥发性脂肪酸浓度的作用，其中大部分会降低瘤胃总挥发性脂肪酸的浓度，也有部分对瘤胃总挥发性脂肪酸的浓度没有影响[37]。WANG等研究发现，在苜蓿日粮条件下补饲三萜皂苷可以显著降低犊牛瘤胃乙酸比例，提高总挥发性脂肪酸浓度[38]。本研究中，在哺乳期犊牛代乳品中添加白头翁皂苷 B4未对瘤胃发酵模式产生显著影响，这与上述结果不同，但与ZHOU等[26]给山羊饲喂茶皂素的结果一致。45 mg·d-1白头翁皂苷B4降低瘤胃总挥发性脂肪酸浓度16.50%，这可能与上述所说的白头翁皂苷 B4的苦味影响犊牛的采食量有关，增加添加量会影响犊牛的采食量，降低瘤胃微生物发酵底物的供应量，由此引起瘤胃液总挥发性脂肪酸浓度的降低。氨态氮是瘤胃微生物合成菌体蛋白的重要氮源，其浓度反映了瘤胃蛋白降解和合成的动态平衡关系，适宜微生物生长的氨态氮浓度为6.3—27.5 mg·dL-1[39]，过低会抑制蛋白质的合成，而过高会引起瘤胃乳头的不完全角质化，这符合本研究所得结果。以上结果显示，白头翁皂苷 B4未对犊牛瘤胃发酵参数产生不良的影响，在一定程度上也证明其安全性。

4 结论

在本研究条件下，在哺乳期犊牛代乳品中添加白头翁皂苷B4不仅可以显著提高哺乳期犊牛14—28日龄的平均日增重，降低饲料转化比，提高饲料转化效率，显著降低犊牛28日龄前粪便评分和腹泻率，还可以提高断奶后犊牛的干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率，促进对总能的消化率和代谢率，同时对犊牛瘤胃发酵参数无不良影响。通过对比 0、15、30、45 mg·d-1白头翁皂苷B4对犊牛的影响发现，其作用效果与添加剂量具有一定的正相关性，且添加量为45 mg·d-1时效果最佳。