赵蔚林 综述,李 君 审校
(湘潭医卫职业技术学院,湖南 湘潭 411102)
肝纤维化是当肝脏出现慢性损伤时机体发生的一系列修复反应,肝内出现细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡,并大量聚集,是多类型细胞信号通路及相关细胞信号分子一起协同的结果[1]。该进程为肝脏慢性疾病进展为肝硬化的相同病理学变化和必经之路。肝纤维化中发挥重要作用者为肝星状细胞(HSC)[2],其作为肝纤维化的主要效应细胞,HSC的活化代表肝纤维化开端的形成,受一系列细胞信息分子和细胞内信号传导的调控,研究阻断作用于这些信号传导过程的方法已成为肝纤维化预防、治疗的主要策略。现简要回顾HSC活化及增殖研究过程中目前研究主要涉及的7种细胞内信号通路,以探索在其作用下肝纤维化的发生及治疗机制,以期为后期更深入的研究提供参考。
HSC系来自间质的一种肝脏非实质细胞类型,位于肝窦周Disse腔中[2],肝脏固有细胞总数中HSC约占15%,非实质细胞中约占30%。正常情况下HSC处于静息状态,呈梭形、多边形,细胞质内有多个脂滴,脂滴内含有丰富维生素A[3]。HSC拥有细长的突起,并向外蔓延,环绕在血窦内皮细胞表面,系人体富含视黄醛衍生物的最主要部位。当肝脏处于正常运行状态HSC表现为静止状态,不表达α平滑肌肌动蛋白[4],并且增殖活性、合成胶原能力均较低。
肝脏处于正常运行中HSC表现为静止状态。当外界机械刺激、炎症等不利因素发生时HSC被激活,表现为静止状态向激活状态转变。肝组织切片运用苏木精-伊红染色不能显示星状细胞,但可运用免疫组织化学将其定位分离后能对其进行体外细胞培养[5]。众多研究证实,肝纤维化发生、发展进程的主要因素为HSC从静止状态向激活状态转变[6]。HSC处于激活状态时一方面表现为通过促进ECM的分泌和增生参与了肝纤维化进展和肝内组织结构的重构[7];另一方面,HSC促进细胞收缩,从而致使肝窦内压上升[8]。以上两方面作用是HSC促进肝纤维化及门静脉高压症发生的重要病理学致病机制。HSC的激活牵涉因素较多,步骤也纷繁复杂,但总体分为启动阶段和持续阶段[9]。启动阶段主要依赖肝脏的旁分泌刺激[10],而持续阶段的进程中最密切关联者为旁分泌及自分泌刺激。
2.1启动阶段 当外界环境改变时,肝脏细胞表型受外界不利因素刺激而发生改变。当外界不利因素损伤肝实质细胞时邻近的肝细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞及血小板等通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子[6],如肿瘤坏死因子α、胰岛素生长因子-1、肝细胞生长因子、血小板源性生长因子(PDGF)等,对HSC发挥作用[11],促进其向肌成纤维细胞样表型转化、激活,并能促使ECM合成增加、肝细胞增殖等。处于激活状态的HSC能自分泌转化生长因子-β(TGFβ)、内皮素(ET)、PDGF、白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子[12],从而致使激活状态持续,即使积极除去不利因素肝纤维化依然能持续进展。
2.2持续阶段 HSC被激活后功能和表型均发生改变,在上述多种因子协同下共同维持HSC的激活持续状态,并能产生纤维形成,从而导致ECM沉积的逐步增多。在此进程中,HSC受旁分泌及自分泌刺激的共同作用[13]。HSC能发挥促进纤维形成的作用,其最直接的方式为HSC被激活后显著增加基质形成。其不但能促进ECM合成总量的增多[14],还能引发ECM合成类型异常。对正常肝脏组织HSC主要表现为合成型胶原。但有外界环境不利刺激时将被激活,从而转为以产生型胶原占主要成分。有研究表明,激活的HSC可能参与肝纤维化发生后其门静脉阻力增加,其发挥收缩功能最重要的刺激因子为ET-1,其具有收缩功能[7],可促使窦周、硬化的肝脏收缩[15],从而发挥阻碍门静脉血流作用。活化的HSC还具有自分泌TGFβ能力,也具有收缩能力,并可诱导HSC分泌ECM[8]。激活状态HSC还具有促进肝组织中大量单核巨噬细胞浸润[16],并起到增强炎症效应,进一步推进肝纤维化进展,最终导致肝硬化的形成[17]。
3.1TGFβ-Smad信号传导 有研究表明,肝细胞自身产生极少ECM,肝纤维化发生时激活的HSC是产生ECM的重要因素[18],因此,肝纤维化进程中最关键环节为HSC激活、增殖、转化等,在该进程中TGFβ发挥着最重要的调节作用,并且Smad为TGFβ特异性的发生底物,故TGFβ-Smad信号通路对HSC具有极其重要的作用。TGFβ在正常情况下HSC极少被表达,当肝组织受到不利因素刺激下HSC被激活,肝组织内TGFβ水平急剧升高。TGFβ受体(TβR)分为Ⅰ、Ⅱ型[11]。TβRⅡ通过细胞外端和配体联结,细胞内丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶随之被激活,TβRⅠ的GS结构域表达呈磷酸化,活化的TβRⅠ促使信号从细胞外向细胞内传递。细胞质蛋白Smads为传递过程中关键的信号传导分子[19]。TGFβ信号通过Smads传递至细胞核内,为通过受体激酶传递的细胞内信号传导途径。细胞内分子自身的构象改变通过磷酸化R-Smad实现,并与Smad4相联结构成多聚体,随后进入细胞核,并与核内特定的DNA序列,如AGAC、CAGAC相联结,通过相联结起到对基因的表达调控作用,但上述相结合的DNA的活性程度相当弱,发挥重要作用者为细胞核内的辅阻遏蛋白、辅激活蛋白与相对应的调控靶基因结合,从而转录,达到对TGβ1发挥生物效应。上述过程中其辅激活蛋白为c-Jun、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CBP)/300kD 蛋白(p300)、淋巴细胞增强因子1(lef-1)等。辅阻遏蛋白为SINP1、Smad核转录共抑制因子(Sno-N)、Ski等。Smad6、Smad7为TGFβ-Smad信号通路中最重要的负性调节因子。Smad6、Smad7调节中Ser/Thr激酶受体关联蛋白(STRAP)能促使Smad6、Smad7与TβR竞争性结合,从而具有负性调节作用。二氨基联苯胺(Dab)是最重要的正性调节因子,能与Smad2中MH-2域结合,促使Smad2、Smad4二者紧密结合,为TGFβ信号放大作用主要的接头蛋白。Dab还能与应激活化蛋白激酶(JNK)通路共同协调纤维结合蛋白(FN)的分泌水平,是TGFβ发挥抗增生效应的重要影响因素。TGFβ-Smad信号通路的主要效应:(1)抑制肝细胞增殖,肝脏受损后能促进Smad2激活、Smad2/4聚合物生成,对分子Sno-N、Ski表达减少,与Smad结合生成复合物,以拮抗TGFβ抗增生作用,从而有利于肝细胞修复[20]。(2)细胞凋亡,加入TGFβ的肝细胞对凋亡的敏感性明显优于HSC及Kupffer细胞等。胱氨半酸蛋白酶(Caspases)、IL-6、构成性转录因子(Sp1)等因子通过TGFβ-Smad信号通路可能诱导细胞凋亡[21]。(3)与其他通路的“交流”。在胞质与胞核交流中与Ras信号通路有联系。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)依附Smad分子连接区,激活Ser磷酸化,阻止其在细胞核内沉积;与Janus激酶/信号传导子与转录激活子(JAK/STAT)也有“交流”。
3.2JAK/STAT信号通路 JAK与JAK结合位点结合后能被自身或受体交叉酪氨酸发生磷酸化而活化,活化后的JAK能促进其受体内酪氨酸残基呈现磷酸化,并能联结附近的氨基酸序列构成“停泊位点”,与此同时,拥有SH2(Src同源结构域的一种)结构域的STAT蛋白聚积至该“停泊位点”。随后JAK催化联结在STAT蛋白的受体,促使完成磷酸化,随后活化的STAT蛋白与受体分离[21],核定位信号通过二聚体、异二聚体的结构暴露从而达到进入细胞核内部并于DNA内特定的调节序列联结,发挥调控肝细胞基因转录过程。有研究发现,一种JAK激酶可协同多种细胞因子的信号传递,一种信号通路细胞因子也能激活多个JAK激酶,但激活的STAT分子与细胞因子具有一定的特异性[11]。一般认为,STAT-1、STAT-4、STAT-6分别是细胞干扰素(IFN)-α/β/γ[22]、IL-2、IL-4受体的细胞内信号传导蛋白,而STAT-3、STAT-5则分别是多种不同细胞因子受体的细胞内共同的信号传导蛋白[12]。有研究表明,JAK/STAT通路能协同多种信号传导,其效应的特异性决定于相对应的受体[13]。STAT中SH2结构域、STAT分子中特定氨基酸序列、细胞因子受体共同决定STAT对细胞因子的特异性选择[14]。JAK/STAT信号通路通过STAT在细胞内异常表达,促进肝细胞之间黏附分子-1的表达[15],导致肝内多种炎症细胞浸润,诱发大量PDGF分泌[23],促进HSC增殖及胶原组织的合成及降解下降,肝内出现大量ECM聚积,从而促使肝纤维化的形成。
3.3PDGF信号传导 2条多肽链共同构成PDGF,A链(PDGF A)相对分子质量18×103,B链(PDGF B)相对分子质量16×103。拥有3个类型二聚体,分别为PDGFAA、PDGFBB及PDGFAB,3个类型之间分别由3对二硫键联结。多个类型信号传导因子将PDGF受体(PDGFR)作为其底物与位于激活状态的PDGFR磷酸化位点相互结合[24]。该内底物均含有1个相似结构的SH-2,PDGFR与其结合,并诱发活化,可激发不同下游蛋白级联磷酸化信号传导通路。主要的下游信号通路为Ras/细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、JAK/STAT、磷脂酶Cγ(PLCγ)等。有研究证实,PDGF还能改变肝细胞内pH值、钙离子水平变化程度,以达到传递信号的目的[16]。有研究表明,PDGF刺激HSC中ERK通路的激活,从而诱导细胞内c-fos水平增加[18]。己酮可可碱为磷酸二酯酶抑制剂,使用含有己酮可可碱的培养基培养HSC,能证实其具有降低c-fos水平,并对HSC增殖具有抑制作用[20]。
3.4Ras/ERK信号通路 Ras是相对分子质量21×103的小G蛋白复合体,Ras与三磷酸鸟苷(GTP)结合呈活性状态,与二磷酸鸟苷(GDP)结合表现失活状态[20]。肝细胞内Ras与细胞膜下生长因子受体结合蛋白(Grb2)、MAPKK激酶等多种蛋白共同构成复合体。Grb2由1个SH2结构域、3个SH3结构域共同组成,SH3结构域与鸟苷酸交换因子(SOS)相互结合,并且PDGFR、Grb2、SOS、Ras在肝细胞膜下与Grb2共同构成复合体[24],在SOS作用下Ras与GDP分离,并与GTP结合,从而致其处于激活状态。Ras激活后能诱导ERK磷酸化,使Ser/Thr蛋白激酶-1、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、ERK一系列被磷酸化后活化。原癌基因Ser/Thr蛋白激酶-1属于一种GTP酶的活化蛋白,能在Ras活化下激活Ser/Thr激酶,从而激活MEK,促使MAPK1/2磷酸化而转为活化状态,其能转移至细胞核,调控转录因子-Ets-like protein-1(Elk-1)、SAP等,并转录c-fos基因;能诱导HSC从G1期进入S期,促进HSC增殖,从而导致肝纤维化的发生。
3.5PI3K信号通路 是由PDGF激活的另一条信号通路。该激酶家族分型较多,与PDGF信号传导关联的属于PI3KA型,其由1个调节亚基P85和1个催化亚基P110组成。P110不仅能使PI磷酸化,还能诱导P85磷酸化。P85拥有3个结构域,分别为SH2、SH2和SH3。SH2能结合PDGFR中酪氨酸残基等,再与P110连结[25],激活PI3K信号通道。其处于激活状态后除能诱发自身磷酸化外,最重要的效应为产生PI作为第二信使,并促进信号向下游传导,发挥促使HSC增殖、迁移等功效。有研究表明,在体外培养的HSC中运用特异性PI3K阻断剂——Wortmannin使HSC停滞于G0/G1期,能显著抑制HSC增殖。有研究揭示,在人HSC中PDGF的促有丝分裂及趋化作用必须有激活状态的PI3K参与[21]。
3.6PI3K/蛋白激酶B(Akt)信号通路 胰岛素生长因子、表皮细胞生长因子、PDGF等刺激因子在与HSC细胞膜相关受体结合后最开始促使PI3K活化,随之PI3K被磷酸化,PIP2转变为PIP3,并诱导PIP3继续磷酸化Akt,Akt激活后转移至细胞核内,调控P53及细胞周期蛋白D1等相关联基因的转录过程,诱导HSC细胞分裂,并能减弱肝细胞凋亡。有研究将HSC、Huh7细胞混合培养发现,Huh7细胞促使PI3K/Akt信号通路激活,从而激活HSC活化[16]。而有研究发现,PI3K抑制剂——PI103具有阻断其信号传递,并明显抑制活化的HSC[23]。
3.7Rho/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路 Rho-GTP酶、ROCK、肌球蛋白磷酸酶是Rho/ROCK信号通路中最重要的组成成分[24]。Rho-GTP酶属于Ras超家族,目前已知有Rho A~G、Rac等多种类型。ROCK为β羟基丙氨酸/β-羟基-α-氨基丁酸蛋白激酶,为Rho下游中重要的关键效应分子[25],能传递Rho信号,诱导HSC内多种氨基酸位点磷酸化,并能促进下游多反应的磷酸化/脱磷酸化,能发挥多种类型的细胞效应。有研究表明,加入Rho/ROCK信号通路阻断剂,使其下游磷酸化,发现对激活状态的HSC具有抑制作用[26]。
肝纤维化是一个由多种细胞、介质和信号通路控制的复杂病理过程,HSC在肝纤维化的发展中具有核心作用。在慢性肝病中HSC经历显著的表型激活并获得纤维化特性,在各种触发因素的影响下进入细胞周期。HSC激活的“起始”阶段与“永久”阶段重叠并持续,其特征是明显的炎症和纤维化反应。在这方面细胞内信号传导障碍、表观遗传变化和细胞应激反应可能是治疗的目标,其目标是使HSC失活。潜在的抗纤维化治疗可能侧重于通过细胞老化、凋亡和(或)免疫细胞清除诱导HSC恢复至非活性状态,并作为潜在的抗纤维化治疗方法。因此,对这些病理生理机制的了解,可为预防肝纤维化发展和进展的药物铺平道路。