无针肌内注射免疫四价流感裂解疫苗的免疫保护效果评价

史伯昌，田崇瑜，许振国，谭凌云，李欣昱，李华斌，贺 威，刘 媛，闫 芳，郑源强，赵忠鹏*

(1.内蒙古医科大学 内蒙古自治区分子生物学重点实验室，内蒙古 呼和浩特010058；2.山西农业大学 动物医学学院，山西 晋中 030800；3.长春海基亚生物技术股份有限公司，吉林 长春 130507；4.吉林省银诺克药业有限公司，吉林 长春 130000；5.安徽医科大学 基础医学院，安徽 合肥 230032)

2021年2月26日，世界卫生组织(WHO)表示，未来有可能流感疫情大暴发，根据CDC各成员国每周报告的流感病例统计和WHO下属机构National Influenza Centers (NICS)和 WHO Collaborating Centers(CCs)搜集的数据，快速发布了北半球季节性流感疫苗毒株。目前已知流感病毒和新冠病毒共感染会加重患者的病情[1]，随着新冠肺炎疫情发展，其病毒变异株不断出现，目前出现的奥密克戎变异株，较疫情初期出现的毒株传播力更强，流感疫苗和新冠疫苗接种工作迎来新的挑战[2]，要求短期内必须完成大规模人群的快速接种。无针连续注射免疫方便快捷，有利于快速实施大规模人群的疫苗接种，同时又可以解决针头恐惧症和避免针刺伤的风险，是替代传统有针注射免疫的有效方法[3-5]。为推进流感疫苗和新冠疫苗的快速接种工作，为无针注射疫苗进入临床试验做准备，本研究在已有四价流感病毒裂解疫苗(有针肌内注射)基础上，对四价流感病毒裂解疫苗(无针肌内注射)品种进行了临床前试验，现总结如下。

1 材料与方法

1.1 无针注射免疫装置及疫苗低压无针注射器(型号MIT-H-IV)和一次性注射头，购自江苏丞宇米特医疗科技有限公司。四价流感病毒裂解疫苗，每剂各含15 μg 血凝素的A/California/7/2009(H1N1)、A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(Bv)、B/Phuket/3073/2013(By)裂解抗原，由长春海基亚生物技术股份有限公司提供。

1.2 实验动物SPF级SD大鼠，250～300 g，每组6只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，饲养于军事医学研究院实验动物中心清洁级动物房；巴马小型猪，25 kg，普通级，每组3只，购自中国科学院动物研究所，饲养于北京通和立泰生物科技有限公司清洁级动物房；10日龄SPF鸡胚购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 体外评价用野生毒株及受体破坏酶(RDE)液野生毒株由军事医学研究院微生物流行病研究所提供；RDE液由中国CDC国家流感中心提供。

1.4 动物免疫程序将SD大鼠和巴马小型猪随机分组。分别以7.5，15，30 μg HA抗原量，阴性对照组以等量PBS，注射于后肢肌肉，无针肌内注射按照无针注射器使用说明操作，有针肌内注射常规操作；免疫2次，间隔21 d。每次免疫后21 d采血并分离血清。

1.5 血凝抑制试验测定血清血凝抑制(HI)效价按1∶4比例将待测动物血清与RDE混合，37℃孵育18 h以消除非特异凝集抑制因子，然后56℃ 50 min灭活RDE。将处理后的待测样品与PBS 1∶1混合，倍比稀释后加入50 μL 含4 HAU的灭活病毒，室温孵育1 h。孵育后每孔加入50 μL 1% 鸡红细胞，混匀，室温静止30 min。以能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度的倒数乘以5为血清HI效价。

1.6 鸡胚中和试验测定血清中和(NA)效价将各型别野生病毒悬液以10倍倍比(10-9～10-1)稀释，每稀释度接种4枚鸡胚，0.2 mL/枚，33～35℃孵育72 h，根据血凝试验判定结果，应用Reed-Meunch公式进行计算EID50。将免疫各组血清混合后，做1∶80～1∶5 120倍倍比稀释，56℃灭活30 min；灭活后各组血清与相应的100 EID50病毒等量混合，置室温中和1 h；中和后立即接种10日龄鸡胚，每稀释度接种4枚鸡胚，每只0.2 mL，35℃培养72 h；冷胚，做直接血凝，按Reed-Meunch法计算抗体中和效价。

1.7 统计学分析使用 Graphpad Prism 9.0进行数据分析，组间抗体滴度比较采用双侧t检验。

2 结果

2.1 四价流感病毒裂解疫苗(无针注射)接种位置的确定结果显示，无针注射器在60～100 PSI个气压时，SD大鼠后肢的皮肤出现明显皮丘，皮丘部位皮肤变薄，发亮，有轻微出血；在100～120 PSI个气压时，大鼠的皮肤注射液体贮留，且无注射液体溢出、注射部位轻微隆起；无针注射器高于120 PSI个气压时无注射液体溢出，注射部位皮肤无皮丘，但注射部位有少量出血(图1A～C)。巴马小型猪在不同气压下出现了相似的情况。因此，无针注射器在100～120 PSI个气压时，SD大鼠无针肌内注射的部位最为准确。无针注射器在200～240 PSI个气压时，巴马小型猪无针肌内注射的部位最为准确(图1D～F)。

A～C.在不同的压力水平下，无针肌内注射SD大鼠后肢肌肉接种四价季节性流感疫苗后注射部位的情况; D～F. 在不同的压力水平下，无针肌内注射巴马小型猪后肢肌肉接种四价季节性流感疫苗后注射部位的情况

2.2 无针肌内注射疫苗免疫原性试验各剂量组无针肌内免疫SD大鼠血清后检测HI效价，结果表明四价流感病毒裂解疫苗免疫SD大鼠后能刺激机体产生较好的抗体效价，二次免疫后抗体水平逐渐提高，而且疫苗的免疫剂量在一定范围内与刺激机体产生的抗体水平呈正相关(图2A，B)。各剂量无针肌内免疫巴马小型猪，其HI抗体效价表现出与SD大鼠相似的趋势。结果表明，无针肌内免疫可完全替代有针肌内免疫接种四价季节性流感疫苗(图2C，D)。

A，B.第1,2次无针肌内注射SD大鼠四价季节性流感疫苗后21 d的HI抗体效价;C，D.第1,2次无针肌内注射巴马小型猪四价季节性流感疫苗后21 d的HI抗体效价

2.3 无针肌内注射与有针肌内注射途径的免疫效果比较各剂量组无针肌内注射及有针肌内注射免疫SD大鼠后检测血清HI抗体效价，结果表明在7.5,15,30 μg HA抗原量时无针肌内注射及有针肌内注射免疫效果相当(图3)。

图3 无针肌内注射与有针肌内注射的免疫效果比较

2.4 四价流感病毒裂解疫苗(无针注射)中和抗体效价结果显示，随接种剂量升高，SD大鼠血清中和抗体效价升高，且2次免疫后保护性中和抗体水平进一步提高(图4A，B)；巴马小型猪无针肌内免疫产生保护性抗体与SD大鼠趋势一致(图4C，D)。因此，SD大鼠及巴马小型猪无针肌内注射免疫后产生的抗体均具有良好的免疫保护性。

A，B.第1，2次无针肌内注射SD大鼠四价季节性流感疫苗后21 d的NA效价;C，D.第1，2次无针肌内注射巴马小型猪四价季节性流感疫苗后21 d的NA效价

3 讨论

在当前呼吸道传染病肆虐的大背景下，全世界疫苗接种工作迎来重大挑战。根据WHO的数据，季节性流感流行每年导致全球300万～500万例严重病例和30万～50万人死亡[6]。随着新冠病毒变异株——奥密克戎的出现，让疫苗接种工作形势更加复杂。此外，针头恐惧症是一种普遍存在的疫苗接种犹豫问题，由于疼痛和针头恐惧症引起的注射焦虑在人群中非常普遍。对针头的恐惧在儿童(33%～63%)和成年人(14%～38%)中都很常见[7-8]，可能导致患者依从性差，以及照顾者、临床医生和卫生专业人员的针刺焦虑[7,9]。鉴于新冠肺炎疫情大流行，对针头的恐惧和对密集人群的管控升级可能导致易感人群拒绝接种疫苗[10]。为适应当前流行病防控要求并推进疫苗接种速度和质量升级，目前迫切需要新的疫苗注射技术。

在过去的几年里，无针注射技术已经升级换代，以解决注射疼痛和针头焦虑的相关问题。尽管仅限于专业医疗人员使用，但目前已经得到了积极的反馈[11-12]，在医疗行业逐步得到推广应用[13-15]。尽管无针注射相关的疼痛与有针注射相当，但人群强烈支持无针注射方法[13]，主要是引起二次伤害的风险会明显降低。重要的是气压式无针连续接种方法非常适用于快速大量的免疫接种并能有效降低财政支出，以应对传染病的大流行[16]。

本研究中，通过准确性试验发现，分别在100～120 PSI个气压和200～240 PSI个气压时，无针肌内免疫可以准确的将疫苗注射入SD大鼠和巴马小型猪的后肢肌内部位并达到有效接种深度，保证疫苗的抗原广泛地与抗原提呈细胞接触，启动机体免疫反应，该无针接种装置可以根据不同人群皮肤特点调节气压，适应不同人群的疫苗接种需求。免疫原性试验中，有针和无针肌内注射均存在剂量线性关系，无针免疫30 μg HA抗原，大鼠和小型猪均可达到免疫的最佳效果。与有针肌内注射相比，相同剂量组实验动物产生的针对不同亚型病毒的中和抗体效价无明显差异，证明无针肌内注射与有针肌内注射刺激机体产生中和抗体的能力相同，提示在免疫原性方面，无针肌内注射完全可以代替有针注射，具有等效性、非劣效性。在诱导产生免疫保护性抗体研究中，不同剂量无针肌内免疫后，实验动物产生的抗体均表现出了良好的免疫保护效果。

综上所述，本研究成功完成无针肌内注射四价流感裂解疫苗品种临床前试验的有效性和安全性评价，证明是一种良好的免疫接种方法，为传染病疫苗快速、安全、高效免疫接种提供了新的技术手段。此外，鉴于成功实施国家新冠肺炎疫苗接种计划的迫切需要，需要更广泛地使用无针注射方案，本研究也为正在进行的无针肌内注射新冠肺炎亚单位疫苗品种的临床前研究工作奠定了理论和技术基础，以使无针肌内注射装置更好地推广应用。