叶绿体特异蛋白质表达谱对本氏烟不同气孔密度的响应

撒世娟 伍涵宇 温媛 陈雪娜 郑蕊 姚新灵

（1. 宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室，银川 750021；2. 宁夏大学西部特色生物资源保护及利用教育部重点实验室，银川 750021）

气孔是植物吸收CO2、释放H2O 的门户，大气CO2上升诱导气孔密度降低［1-3］，并对光合作用产生影响。研究结果显示，CO2富集诱导气孔导度降低达22%。气孔导度降低可能是植物对高CO2浓度的主动适应过程［4］，该适应过程与叶绿体如何联系尚属未知。

随着光合作用相关蛋白识别及功能注释的不断深入，气孔运动与叶绿体间的联系逐渐显现，其中包括共同影响叶绿体和气孔动态的环境因素如光照、高温，还有叶绿素a/b 结合蛋白LHCB（light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins）和碳固定代谢参与蛋白等，这些线索为揭示气孔动态与叶绿体间的代谢联系提供了基本依据。

研究发现，高温导致气孔导度降低的同时，叶绿体荧光参数也随之降低，叶绿体和气孔哪个首先受到环境因素的影响有待确定［5］。早期研究发现，保卫细胞中表达叶绿素酶基因，使保卫细胞叶绿素缺乏，继而导致气孔形态瘦小［6］，意味着叶绿体光系统参与了气孔的形态发生。

叶绿体光系统I（PSI）是光驱动的氧化还原复合体［7］，其反应中心核心组成蛋白包括PSAN（photosystem I reaction center subunit PSI-N）、PSAD-2（photosystem I reaction center subunit II-2）、PSBC（photosystem I iron-sulfur center protein）、CB5-E（cytochrome b5） 和AVP1（Arabidopsisvacuolar proton-pumping pyrophosphatase 1）。PSI 组 装 蛋 白ycf4（cytochrome f4）等构成了调控PSI 积累的网络，质体 蓝 素 DRT112（DNA-damage-repair/toleration） 参与PSI 与细胞色素间电子传递。PSI 叶绿素a/b 结合蛋白2（light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins 2, LHCA2）介导LHCII-PSII 磷酸化及其迁移，促进PSI-PSII-LHCII 和PSI-LHCII 超复合体形成［8-10］。

叶绿体PSII 反应中心蛋白质PSBA（PSII protein D1）、PSBB（PSII CP47 reaction center protein）、PSBC（PSII CP43 reaction center protein）和修复蛋白PSB27-H1（PSII repair protein PSB27-H1） 等 与叶绿素结合产生光诱导的光化学反应，PSBA 和PSB27-H1 等也参与PSII 损伤修复［10-12］。光系统II稳定/组装因子HCF136（photosystem II stability/assembly factor HCF136）、高叶绿素荧光表型HCF173（high chlorophyll fluorescence phenotype 173）和PSII亚 基PSBQ2（oxygen-evolving enhancer protein 3-2）参与PSII 组成亚基和细胞色素559 的组装［13-14］，细胞 色 素b559 亚 基α（PSII cytochrome b559, PSBE）是PSII 反应中心电子传递链组分的核心组分［15］，PETC（cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit）担负PSII 和PSI 间线性和环形电子传递［10,16-18］，在光系统上游，原叶绿素酸酯还原酶B（protochlorophyllide reductase B, PORB）催化原叶绿素酸酯还原产生叶绿素酸酯［19］，cis-八氢番茄红素去饱和酶PDS3（cis-phytoene desaturase）等代谢八氢番茄红素形成ζ-胡萝卜素［20］，ATP 合成酶亚基δ（ATP synthase δ subunit, ATPD）等组成了光合磷酸化ATP 合成酶［21-22］，单脱水抗坏血酸还原酶4（monodehydroascorbate reductase, MDAR4）参与H2O2解毒抗坏血酸合成［23-24］。

在碳固定下游，3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPB（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、1- 磷酸葡萄糖腺苷转移酶APL3（glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 3）、二磷酸果糖醛缩酶FBA3（fructose-bisphosphate aldolase 3）、6- 磷 酸葡萄糖异构酶PGI1（glucose-6-phosphate isomerase 1）、苹果酸异丙酯脱氢酶IMD2（isopropylmalate dehydrogenase 2）、NADP 依赖的苹果酸酶4（NADPdependent malic enzyme 4, NADP-ME4）和磷酸丙酮酸激酶1（pyruvate phosphate dikinase 1, PPDK1）调控三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环CO2固定［25］。谷氨酸合成酶GLU1（glutamate synthase 1）和谷胱甘肽转移酶GSTF8（glutathione S-transferase F8）代谢还原谷氨酸与疏水亲电配体的接合［26-28］。

表皮模式因子2（EPIDERMAL PATTERNING FACTOR2,EPF-2）和Stomagen分别正向和反向调控叶片气孔密度, 继而影响光合作用［29-32］。气孔形成后，叶肉细胞蔗糖和苹果酸积累、保卫细胞叶绿体储存淀粉降解均参与气孔运动［33-34］。尽管叶绿体如何介导气孔发育有待确定，但可以确定气孔发育和运动与叶绿体内相关代谢密切关联。

研究发现，叶绿素结合蛋白 CP24（chlorophyllbinding protein 24）正向响应光照，反向调控叶绿素积累［35］，叶绿素a/b 结合蛋白LHCB 6（light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins 6）过量积累，则气孔对赤霉素（abscisic acid, ABA）更为敏感［36］，叶绿素b 缺失突变体的气孔功能异常，而遮阴条件下LHCB 6 积累增加，气孔功能随即恢复［37］，叶绿体LHCB 成员与气孔动态如何关联有待确定。

本研究通过体内调控本氏烟草表皮模式因子2（Nicotiana benthamiana EPIDERMAL PATTERNING FACTOR2，NtEPF2）基因表达，获得不同气孔密度转化株系，测定不同气孔密度叶片蛋白质组表达谱，揭示随气孔密度变化叶绿体组分特异表达蛋白质及其表达变化，明确叶绿体组分蛋白质对气孔动态的响应，结果对深入研究气孔动态具有重要作用，对高效碳固定分子育种具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

重组根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101-epf2-和GV3101-epf2+由本实验室保存，其中分别含有35S 启动子驱动的正义和反义StEPF2（DMG400027541）cDNA 重组载体pC-epf2-和pCepf2+，StEPF2 为马铃薯（Solanum tuberosumL.）表皮模式因子编码基因StEPF2（DMG400027541）。

供试材料本氏烟草（Nicotiana benthamiana）室内培养采用旁氏培养基质，试管苗及基质培养苗培养条件为（24±2）℃，14 h 光照，10 h 黑暗，光照强度为100 μmol/（m2·s），相对湿度60%-80%，土壤含水量70%±5%。

1.2 方法

1.2.1StEPF2-体内转化及表达阳性株系筛选 采用撒世娟等［38］的方法，完成正义和反义StEPF2 在本氏烟草体内转化。转化株系培苗培养生长第30 天时，采集其顶端幼叶，分别提取gDNA 和总RNA，用于转化阳性株系选择。转化阳性株系PCR 选择用表1 所示的引物EP，按照上海酶联生物科技有限公司生产的GUS 试剂盒说明书，完成PCR 阳性株系GUS 染色筛选。

按照大连宝生物工程有限公司生产的SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明，分别用表1 所示的StEPF2 特异引物EP+和EP-完成StEPF2 mRNA 积累RT-PCR 半定量测定，用比较Ct 值法计算StEPF2 相对表达量。

表1 实验所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

1.2.2 阳性株系表型测定 基质培养苗龄达到30 d时，选择并标记相同位置叶片及叶片相同位置，用15%的硝化纤维素丙酮液均匀涂抹标记位置叶片背面，静止15 min 后用镊子剥离涂抹位置叶片表皮，置于载玻片蒸馏水滴中，用镊子展平叶片表皮，用纸吸干多余水分，在展平叶片表皮加10%染色碘液，静止1 min 后加洗脱蒸馏水，用纸吸干多余水分和碘液，加盖玻片封闭，排除气泡和浮色晾干制片并标记，显微镜下观察并拍照，以每平方毫米（mm-2）叶片面积为单位计数气孔数，计数设置3 次，每次计数重复3 次。叶绿素相对含量和光合参数测定按照撒世娟等［38］的方法。

1.2.3 叶片样品iTRAQ 气孔密度增加、减少和对照株系叶片样品总蛋白提取、质检、定量、去盐，蛋白质酶水解、iTRAQ 标记均按照Spanos 等［39］的方法进行，水解产物标记后样品等量混合酸化后，用Thermo DINOEX Ultimate 3000 BioRS 色谱仪（Thermo Fisher，USA）分离肽段，用QSTAR XL 质谱仪（Applied Biosystems，USA）采集同位素标签丰度等数据，计算同一多肽不同同位素标签丰度比值，以此作为同一多肽的相对表达量。

1.2.4 数据及分析 参考Vaudel 等［40］的方法，完成原始数据处理和Uniprot 数据库检索，设定相对表达量t检验显著为阈值，选择上下调及检出DEPs，在STRING 平 台（https://www.string-db.org/） 选 择多序列检索工具，用所选择DEGs 的氨基酸序列，mapping 拟南芥基因组，设定mapping 一致性大于60%为阈值，选择气孔密度增加和减少DEPs。

在GO（GENE ONTOLOGY） 界 面（http://geneontology.org/），用mapping ID 在线完成GO 富集分析；在Panther 数据库（http://pantherdb.org/tools/）平台，分别选择和下载包含叶绿体的GO 归类ID 及其包含的全部DEPs ID 和功能注释，用于其后的叶绿体组分DEGs 比较。

2 结果

2.1 叶绿素积累模式响应气孔密度变化

筛选得到StEPF2 抑制和过量表达株系各2 株，叶片StEPF2 基因mRNA 相对表达量测定结果如图1-A 所示，StEPF2 过量和抑制表达株系叶片StEPF2基因mRNA 相对表达量，分别极显著高于和低于对照，表明研究实现了StEPF2 体内过量和抑制表达，获得了StEPF2 过量株系ntepf-p1 和ntepf-p2 及抑制株系ntepf-m1 和ntepf-m2。如图1-F-H 所示，叶片气孔密度区别明显。如图1-B-D 所示，ntepf-p1 和ntepf-p2 株系叶片气孔密度、气孔导度及净光合速率分别低于对照株系，ntepf-m1 和ntepf-m2 株系叶片气孔密度、气孔导度及净光合速率分别比对照提高了约40%、200%和67%，结果表明，StEPF2 过量和抑制分别降低和增加了气孔密度，气孔密度正向改变气孔导度和净光合速率。

图1 株系 ntepf-m 和ntepf-p 气孔密度、叶绿素积累、光合测定和气孔观察结果Fig. 1 Assay on stomatal density, chlorophyll accumulation and photosynthesis as well as stomata observation for ntepf-m and ntepf-p lines

叶绿素含量测定结果如图1-E 所示，高气孔密度株系上、中、下叶片叶绿素含量均值高于对照均值43%，且保持了与对照下部叶片同样的高水平，对照株系叶片叶绿素含量自上而下呈现增加的常规模式。低气孔密度株系叶片叶绿素含量与对照株系的常规模式完全相反，即上、中、下叶片叶绿素含量呈现递减模式。

以上结果表明，气孔密度增加不仅加速了叶片叶绿素形成，而且保持了不同叶龄叶片叶绿素高水平积累。气孔密度降低加速了幼叶叶绿素积累，但随叶龄增加而逐渐减少，与对照株系叶绿素积累自上而下增加的模式比较，气孔密度降低株系上、中、下叶片叶绿素积累呈现倒置模式。

2.2 气孔密度增加产生的叶绿体响应

依据设定的DEPs 相对定量阈值，选择iTRAQ识别DEPs 的结果显示，响应气孔密度降低显著上下调的DEPs 为381 个，气孔密度增加显著改变了357 个DEPs 的积累量（P<0.05）。以DEPs 序列映射拟南芥基因组，选择序列相似性大于60%的DEPs进行GO 归类富集，结果如表2 所示，ntepf-m 中识别了更多分子功能GO ID，更多细胞组分的变化发生于ntepf-p 中。

表2 与拟南芥同源物相似性大于60% DEPs 的GO 富集结果Table 2 GO enrichment with DEPs sharing ＞60%similarity with orthologs in Arabidopsis

计算本研究识别的GO ID 所含DEPs 个数（upload）与拟南芥基因组注释记载中GO ID 所含DEPs 总数（REFLIST）间的比值（U/R, upload/REFLIST），用于比较随气孔密度变化的GO归类变化。从GO 富集中选择叶绿体、类囊体和光系统GO ID，比较获得气孔密度增加和降低共同GO ID（图2）。

图2 气孔密度上、下调叶片DEPs GO 富集中共同出现的叶绿体GO IDsFig. 2 Chloroplast common GO IDs in GO enrichment of DEPs identified from the leaves of up- or downstomatal density

气孔密度增加和降低共同GO ID 共计13 个，U/R 比值比较发现，共同GO ID 中的ntepf-m 株系U/R比值均显著高于ntepf-p 株系，其中，ntepf-m 株系GO:0009543 和GO:0031978 两 个GO ID 的U/R 比 值均为0.36，即气孔密度增加调控了这两个GO ID 包含DEPs 的表达，调控DEPs 数量达到各自GO ID 包含全部DEPs 的36%，而气孔密度降低仅调控了全部DEPs 的13%。表明气孔密度增加牵动了更多的DEPs 表达变化，即气孔密度增加对叶绿体组分等产生更明显影响。

比较识别了如表3 所示的ntepf-m 株系特异GO ID，10 个GO ID 中的7 个分别来自光系统I 和光系统II，且U/R 比值平均数0.34，表明气孔密度增加特异调控了光系统近1/3 组分的表达。比较结果未见ntepf-p 株系特异GO ID，表明气孔密度降低并未诱导叶绿体特异DEPs 表达变化，相对而言，气孔密度增加诱导了更多叶绿体特异DEPs 表达变化，这与ntepf-m 和ntepf-p 株系两者共同GO ID 中DEPs表达变化趋势一致。

表3 气孔密度增加特异DEPs GO 富集Table 3 GO enrichment with stomatal density rising specific DEPs

2.3 气孔密度增加正向调控PSI电子传递

下载各GO ID 所含DEPs，删除重复项及未审核（unreviewed）DEPs 后，选择得到如图3 所示的22 个共表达DEPs，其中随气孔密度增加表达量降低的DEPs 有15 个（图3-A, B），表达量随之增加的DEPs 有7 个（图3-C）。

图3 气孔密度上、下调叶片共表达DEPs 积累变化Fig. 3 Accumulation variation of co-expreesion DEPs resulting from the leaves of up- or down-stomatal density

7 个DEPs 表达量随气孔密度正向变化，且其在高气孔密度下的积累量较低气孔密度高2.2-10.6倍，另外15 个DEPs 的积累量与气孔密度呈反向变化，即低气孔密度下的积累量较高气孔密度高2.0-24.6 倍。

高气孔密度下显著升高的7 个DEPs 中，IMD2、NADP-ME4 和PPDK1 参与CO2固定的三羧酸循环（TCA）。光系统I 反应中心蛋白N（PSAN）、细胞色素b5（CB5-E）、质子泵（AVP1）是光系统电子传递链的核心组分。这些蛋白质显著增加结果表明，气孔密度增加正向调控TCA 和PSI 电子传递。

气孔密度降低上调了15 个共表达DEPs，光系统II 稳定/组装因子HCF136、高叶绿素荧光表型HCF173 和光系统II 亚基Q-2（PSBQ2）参与PSII 组成亚基D1、D2 和细胞色素559 的组装，质体蓝素（DRT112）参与PSI P700 与细胞色素b6-f 间电子传递，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPB）参与TCA 中1,3二磷酸甘油酸还原，八氢番茄红素去饱和酶3（PDS3）代谢八氢番茄红素形成ζ-胡萝卜素。

这些DEPs 积累随气孔密度降低上调表达的结果表明，气孔密度降低产生了PSII 组成亚基组装、PSI 电子传递和TCA 的改变，胡萝卜素合成增加预示着气孔密度降低增强了光保护反应。

2.4 气孔密度增加促进PSII-PSI复合体形成

气孔密度增加条件下，识别了如图4 所示的15个DEPs，其中如图4-A 所示的PSI 叶绿素a/b 结合蛋白2（LHCA2）和细胞色素b559 亚基α（PSBE）积累分别上调了（1.77±0.22）和（1.62±0.20）倍。LHCA2 介导LHCII-PSII 磷酸化及其迁移，促进PSIPSII-LHCII 和PSI-LHCII 超复合体形成，电子传递链组分PSBE 是PSII 反应中心的核心组分之一，两者积累上调的结果表明，气孔密度增加，加速了PSIIPSI 复合体形成和其电子传递。

图4 气孔密度增加特异响应DEPs 积累变化Fig. 4 Accumulation variation of specific DEPs in response to rising stomatal density

气孔密度增加条件下，识别了如图4-B 所示的7 个DEPs 表达特异下调表达，其中PSI 反应中心亚基II-2（PSAD-2）减少了约18%，PSI 铁硫中心蛋白（PSBC）减少了约81%。PSI 是光驱动的电子传递氧化还原复合体，这些PSI 基本组分积累随气孔密度增加而降低的结果表明，气孔密度增加，改变PSII 和PSI 间电子传递模式。

气孔密度增加条件下，识别了如图4-C 所示的4 个特异下调表达PSII 组成蛋白质，PSII 反应中心组 成 蛋 白PSBA、PSBB（CP47） 和PSBC（CP43）积累分别减少了约58%、56%和81%，三者下调表达的结果表明，气孔密度增加，改变了PSII 组分及其与叶绿素结合模式。PSB27-H1 积累下调也意味着PSII 光系统损伤修复的改变。

结合图1-B、D 和E 结果表明，气孔密度增加，改变了PSII 反应中心蛋白质结合及光系统损伤修复模式，加速了PSII-PSI 复合体形成和其电子传递，保持了不同叶龄叶片叶绿素高水平积累，净光合速率随之增强。

气孔密度增加增强了PSII 和PSI 间的电子传递、光损伤修复水平降低的结论，与本文结果2.3 中气孔密度增加，增强了电子传递、降低光损伤修复的结论一致。

2.5 气孔密度降低倒置了叶绿素积累模式

气孔密度降低条件下，识别了如图5 所示的特异表达蛋白质。如图5-A 所示，PORB 和ATPD 分别是对照的（11.85±2.56）和（4.29±1.22）倍，PORB 催化原叶绿素酸酯还原产生叶绿素酸酯，ATPD 是光合磷酸化中F1F0 复合体组分，两者显著上调表达的结果表明，气孔密度降低增加了叶绿素积累和光合磷酸化ATP 合成。

气孔密度降低诱导了5 个蛋白质特异下调表达，其表达倍数如图5-B 所示，1-磷酸葡萄糖腺苷转移酶3（APL3）、二磷酸果糖醛缩酶3（FBA3）、6-磷酸葡萄糖异构酶1（PGI1）积累随气孔密度减少分别降低了约33%、53%和59%，即气孔密度降低，碳固定下游代谢酶的积累仅是对照的约一半。

图5 气孔密度降低特异响应DEPs 积累变化Fig. 5 Accumulation variation of specific DEPs in responses to lowering stomatal density

结合图1-B、D 和E 结果，考虑到用于iTRAQ的样品是顶端幼叶，以上结果表明，气孔密度降低，增加了幼叶叶绿素积累和光合磷酸化ATP 合成，但碳固定下游代谢活性显著降低，随叶龄增加叶绿素积累递增，株系上、中、下叶片叶绿素积累呈现倒置模式。

3 讨论

3.1 提高气孔密度可能是应对大气CO2升高的有效途径

CO2还原和H2O 光解发生在叶绿体内，气孔作为CO2和H2O 进出叶绿体的开关，响应环境变化调控CO2和H2O 的进出。长期进化形成了气孔相对固定的调控模式，维持CO2和H2O 的进出平衡，协调植物对环境的适应［41-42］。大气CO2上升及温室等人造环境的应用，要求植物重新建立气孔适应环境的平衡［42］。揭示光合作用响应气孔变化机制，不仅有助于更深入理解气孔的工作原理，而且可能开辟通过调控气孔增加作物产量的全新育种思路。

有研究已明确，气孔密度随大气CO2上升而降低［1-3］，CO2富集诱导气孔导度降低达22%［4］，表明以往大气CO2浓度是植物碳固定的饱和临界点。本研究发现低气孔密度导致CO2吸收不足，碳饥饿导致叶绿体早衰，碳固定仅为高气孔密度下的1/3；高气孔密度增强光合电子传递，维持高水平叶绿素积累和CO2固定；高低气孔密度导致的相反结果为应对大气CO2升高提供有益的启示。

3.2 LHCA2促进PSI-PSII-LHCII超复合体形成，参与了气孔响应

光捕获复合体PSI（LHCI）由高达70 个叶绿素a 和b 及15 个胡萝卜素和蛋白组成，其功能是吸收光能［10］，LHCA2 介导LHCII-PSII 磷酸化，促进PSI-PSII-LHCII 和PSI-LHCII 超复合体形成［13-14］。本研究发现LHCA2 积累随气孔密度增加而上升，即气孔密度增加诱导LHCA2 积累增加，两者呈现正向变化；低气孔密度诱导LHCA2 积累减少，与PSIPSII-LHCII 和PSI-LHCII 超复合体结合的叶绿素应该减少；高温诱导气孔导度和叶绿体荧光参数降低、幼叶气孔形成和叶绿素合成基因呈现低水平表达的研究报道［5］，证实了以上推测结论。

3.3 气孔密度、碳固定正向调控叶绿素积累

正常气孔密度下，幼叶气孔形成和叶绿素合成基因呈现低水平表达［5］，低气孔密度下，幼叶PORB 和ATPD 高表达显著增加了叶绿素积累，但随着叶片发育，叶绿素积累迅速降低。该结果为气孔密度决定叶绿素积累提供了直接证据，结果也意味着大气CO2上升诱导的气孔密度降低可能减少光合产物的积累。

研究显示，保卫细胞中表达叶绿素酶基因导致叶绿素缺乏及气孔形态瘦小［6］，叶肉细胞光合作用下游产物蔗糖和苹果酸积累参与气孔运动动态［11］，即除了外界环境因素调控气孔动态外，叶绿体内代谢物也对气孔动态产生反馈调控。本研究发现气孔密度正向调控叶绿素积累，这些结果指向气孔密度与叶绿素积累存在相互作用，叶绿素B 缺失突变体的气孔功能异常也证实了这一点［15］，互作途径解析则需本研究识别的响应气孔密度动态的DEPs。

3.4 气孔密度可能成为改变光系统损伤修复的途径

PSII 反应中心组成蛋白PSBB 和PSBC 可结合叶绿素启动光化学反应，又具有光系统损伤修复功能［22］。正常气孔密度下，遮阴可弥补叶绿素B 缺失，恢复气孔功能［37］，遮阴意味着光保护色素胡萝卜素减少、光损伤修复水平下降，叶绿素积累增加吸收更多光子，以弥补遮阴的光照不足。本研究发现气孔密度增加，PSBB 和PSBC 积累随之减少，光系统损伤修复水平下降。遮阴和气孔密度增加均导致光损伤修复水平下降，遮阴减少光照，无需高水平光系统损伤修复，高气孔密度下的低水平光系统损伤修复意味着，高气孔密度诱导的光系统增强了对光照的耐受，即调控气孔密度增强植物对光照的适应性存在潜力。

4 结论

气孔密度增加，加速了PSII-PSI 复合体形成和其电子传递，降低了光损伤修复水平，保持了不同叶龄叶片叶绿素积累和净光合的高水平，碳固定随之增加。气孔密度降低，幼叶叶绿素和ATP合成增强，碳固定下游代谢酶积累减少，随叶龄增加，叶片叶绿素积累模式发生了倒置。