药食同源组方联合益生菌对免疫低下 小鼠的免疫增强作用

刘海春，胡晨旭*，王家明，刘瑞，李敬华

（1.龙口南山养生谷肿瘤医院，南山健康产业研究院，山东龙口 265718）

（2.天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）

（3.天津小薇生物科技有限公司，天津 301799）（4.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700）

药食同源食品具有功能温和、副作用小和稳定性好等诸多优点，现已被广泛用于临床预防和康复治疗中。药食同源组方的多靶点作用是通过对机体整体调整而发挥出相应的药理活性和免疫作用[1,2]。肿瘤患者术后身体虚弱、免疫力差、肠道菌群失调，严重影响患者围手术期的恢复及预后，药食同源中药在肿瘤病人围手术期恢复及预后上的应用越来越广泛[3-6]。

人参性温味甘，大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神。茯苓性平味甘，利水渗湿，健脾，宁心。黄精性平味甘，补气养阴，健脾，润肺，益肾。当归性温味甘，补血活血，调经止痛，润肠通便。山药性温味甘，健脾，补肺，固肾，益精。莲子性平味甘，补脾止泻，益肾涩精，养心安神。海参味甘咸，补肾经，益精髓，抗肿瘤，增强免疫力。四君子汤（《太平惠民和剂局方》），九转黄精丹（《太平惠民和剂局方》），海蛤散（《圣济总录》），消瘤丹（《洞天奥旨》），活血散瘿汤（《外科正宗》），益气清金汤（《金鉴》），消湿化怪汤（《石室秘录》），十全散《传信适用方》等古方均频繁使用以上药食同源的中药，主要用于古代肿瘤及康复治疗。人参和茯苓健脾益气，温而不燥；黄精和当归滋阴养血；山药和莲子增强健脾益气，安神之功效；海参则具有增强补血免疫之功效。整个组方作为药食同源Ⅲ号组方。药食同源Ⅳ号则是Ⅲ号中的海参酶解为小分子海参肽，更有利于体弱患者肠道吸收，补充营养，增强免疫力，加快康复。

益生菌是以肠道为主要作用靶点来调控预防各类疾病发生的有益活性微生物[7,8]，益生菌进入肠道后与宿主菌群相互作用，产生一些特定的代谢产物，如短链脂肪酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素等，从而抑制病原菌的生长[9,10]。大量研究报道，益生菌在肿瘤免疫中发挥着重要作用[11-15]。本文以药食同源组方与复合益生菌制剂为研究对象，研究药食同源组方组（Ⅲ号）、药食同源改良组（Ⅳ号）、益生菌组（Ⅴ号）和Ⅳ号与益生菌联用组（Ⅵ号）对模型小鼠胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞增殖和血清中IgG、IgA和IgM生成水平的影响，为进一步研究药食同源组方与益生菌制剂联合使用，增强免疫作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料与动物

药食同源Ⅲ号固体冲剂主要由人参、茯苓、黄精、当归、山药、莲子和海参制备而成（简称Ⅲ号），药食同源Ⅳ号固体冲剂主要由人参、茯苓、黄精、当归、山药、莲子和海参肽制备而成（简称Ⅳ号）。海参肽由蛋白酶酶解后获取冻干粉。药材均购自北京同仁堂（天津金元宝商厦店）；新鲜海参购自天津王顶堤水产海鲜商贸市场；乳双歧杆菌BR001、植物乳杆菌LZ010、鼠李糖乳杆菌GS013由天津小薇生物有限公司提供，活性300亿CFU/g。实验动物昆明小鼠生产许可证：SCXK（军）2007-004，合格证号：00549571。

1.1.2 实验药品

二甲基亚砜（DMSO），磷酰胺（CTX），北京索来宝公司；RPMI1640培养基，Hank's溶液，刀豆蛋白（Con A），海博生物公司；胎牛血清，瑞根特公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），美国Sigma公司；蛋白酶，西亚公司；IFN-γ、TNF-α、IL-2和IgG试剂盒，上海江莱生物股份有限公司。

1.1.3 实验仪器

TJS-3000超声波提取浓缩机，宁波新芝生物科技有限公司；CO2培养箱，美国赛默飞世尔科技公司；ALPHA1-4冷冻干燥机，德国Marin Christ；MIKRO-220R冷冻离心机，德国Hettich科学仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；i3x酶标仪，美国MD公司；PB160Z-S电子天平，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CTX模型建立与给药

SPF级Balb/c小鼠60只，雄性，体质量18~20 g，温度20~25 ℃，相对湿度50%±5%，光照时间12 h/12 h环境下饲养一周后，按国家新药（西药）临床前研究指导原则汇编[16]的方法建立环磷酰胺（CTX）所致免疫功能损伤模型，除空白对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，其余各组小鼠连续腹腔注射4 d环磷酰胺（CTX），注射量为100 mg/kg。给药后4 d，第4天检测眼眶血白细胞数。造模成功标准：CTX模型组小鼠的白细胞数明显低于空白对照组（P＜0.01），且出现体重下降，脱毛，免疫器官组织损伤等现象。造模1 d后给药，每天灌胃1次，连续给药14 d。空白对照组和模型组每天服用等体积的生理盐水。

1.2.2 免疫器官重量指数测定

各组小鼠14 d给药后，禁食12 h（不禁水），称体质量，颈椎脱臼处死小鼠，获取胸腺和脾脏，滤纸去除残血，记录质量。取眼球血清，胸腺、脾脏等器官组织，并保存于零下80 ℃超低温冰箱中。免疫器官重量指数按下列公式计算：

式中：

S——胸腺指数，g/kg；

m——小鼠体质量，kg；

ms——脾脏质量，g；

T——胸腺指数，g/kg；

mt——胸腺质量，g。

1.2.3 巨噬细胞吞噬率、吞噬指数的测定

末次给药前3 d，每组随机抽取小鼠10只，腹腔注射1 mL淀粉肉汤（60 mg/mL）；末次灌胃后第2天，向小鼠腹腔注射1 mL（5%）的鸡红细胞生理盐水混悬液，轻揉小鼠腹部并吸出小鼠腹腔液，滴1滴于洁净的载玻片上，瑞氏染色5 min，油镜下观察。公式如下：

式中：

P——吞噬百分率，%；

n1——吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数；

n0——巨噬细胞总数；

I——吞噬指数；

n2——巨噬细胞吞噬鸡红细胞的总数。

1.2.4 淋巴细胞转化实验

无菌环境下取脾脏，置于含Hank's液的平皿中，配置成细胞悬液，用RPMI 1640培养液配置细胞浓度每毫升5×106个，于96孔培养板中培养，每孔200 μL。每个样本设Con A液及空白对照孔，恒湿培养箱中孵育72 h（37 ℃和5% CO2）。结束培养前4 h，每孔中加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），经4 h培养后，每孔中加入100 μL DMSO，振摇10 min，待结晶溶解后，酶标仪读取OD值（570 nm波长）。

式中：

SI——刺激指数；

OD1——试验孔OD570值；

OD0——对照孔OD570均值。

1.2.5 NK细胞活性的测定

采用MTT法测定自然杀伤（NK）细胞活性，以小鼠脾淋巴细胞悬液（每毫升5×105个）为效应细胞。以YAC-1（每毫升5×104个）细胞为靶细胞。效靶细胞孔加入效应细胞和靶细胞各100 μL；靶细胞孔加入靶细胞和完全培养液各100 μL；效应细胞孔加入靶细胞和完全培养液各100 μL，孵育48 h（37 ℃，5% CO2），再加入MTT溶液10 μL（5 mg/mL），继续培养4 h，再将各100 μL上清液加入96孔板，每孔加100 μL DMSO，振摇10 min。酶标仪读取吸光度（570 nm）。

式中：

K——NK细胞的杀伤活性，%；

A1——效靶细胞吸光度；

A2——效应细胞吸光度；

A3——靶细胞吸光度。

1.2.6 血清免疫球蛋白的测定

取小鼠血清样本，检测免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平（具体操作流程严格遵循试剂盒说明书）。

1.2.7 统计学分析

用SPSS 17.0统计数据，实验数据用均数±标准差表示，方差分析组间差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 药食同源组方对免疫功能低下小鼠免疫脏器指数的影响

本文采用经典CTX模型，可通过抑制快速增殖的血细胞DNA合成从而广泛抑制机体免疫功能[17]。胸腺和脾脏是机体主要的免疫器官，胸腺和脾脏指数是衡量机体非特异性免疫能力的重要指标之一。如下表1数据显示，与空白对照组相比，模型组脾脏指数（2.11 g/kg）和胸腺指数（1.22 g/kg）均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ号组脾脏指数（2.32、2.54、2.52、2.82 g/kg）和胸腺指数（1.46、1.67、1.50、1.92 g/kg）显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；Ⅳ与Ⅲ相比较，胸腺指数明显升高（1.67 g/kg＞ 1.46 g/kg），差异有统计学意义（P＜0.01），说明海参肽起到了积极的免疫作用。Ⅵ与Ⅳ相比较，脾脏指数明显升高（1.92 g/kg＞1.67 g/kg），差异有统计学意义 （P＜0.01），说明益生菌具有促进药食同源物质吸收的作用，增加了药食同源的效果；同时益生菌本身也具有促进免疫器官指数增加的作用；因此益生菌组与药食同源改良组结合，具有协同增效作用。但Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ号组与空白组正常小鼠免疫器官相比，均无法达到非造模正常水平，其中Ⅵ号组最接近正常小鼠免疫器官水平。张永娟等[18]研究亦表明海洋缢蛏多肽具有显著提高脾脏和胸腺指数（3.72和1.16）的作用，其中脾脏指数高于组方Ⅲ~Ⅵ；但胸腺指数低于组方Ⅲ~Ⅵ，表明多肽具有增强免疫功能作用，同时不同组方或者多肽对不同免疫器官具有不同程度的修复与促进生长作用。

表1 组方Ⅲ~Ⅵ对免疫力低下模型小鼠免疫器官的影响Table 1 Effects of Ⅲ~Ⅵ groups on thymus indeхes and spleen indeхes of immunosuppressive mice (±s, n=10)

表1 组方Ⅲ~Ⅵ对免疫力低下模型小鼠免疫器官的影响Table 1 Effects of Ⅲ~Ⅵ groups on thymus indeхes and spleen indeхes of immunosuppressive mice (±s, n=10)

注：与空白对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；Ⅳ与Ⅲ比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01；Ⅵ与Ⅳ比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01。下表同。

组别 给药剂量/(mg/kg) 脾脏指数/ (g/kg) 胸腺指数/ (g/kg) 对照组 3.46±0.65 2.63±0.41 模型组 2.11±0.39△ 1.22±0.31△△Ⅲ 400 2.32±0.68▲ 1.46±0.86▲ Ⅳ 400 2.54±0.21◇◇ 1.67±0.43◇ Ⅴ 200 2.52±0.66▲▲ 1.50±0.86▲▲Ⅵ 600 2.82±0.62◆◆ 1.92±0.92◆◆

2.2 药食同源组方对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性的影响

如表2所示，模型组小鼠的吞噬百分率（46.55%）和吞噬指数（0.41）均显著降低（P＜0.05），表明建模成功。与模型组比较，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组可不同程度提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数（0.43、0.45、0.44、0.62）和吞噬百分率（47.66%、50.30%、48.23%、58.08%）（P＜0.05或P＜0.01），但均未达到空白对照组吞噬百分率（66.43%）和吞噬指数（0.71）水平。其中Ⅵ组吞噬能力最强，说明益生菌与药食同源组作用靶点不同，且益生菌能有效促进药食同源组方吸收，可更大程度提高吞噬细胞数量，增强免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。刘春红等[19]研究表明植物乳杆菌C88联合人参多糖对巨噬细胞的吞噬指数为0.05，具有一定的吞噬能力，但吞噬指数明显低于Ⅲ~Ⅵ组（0.4~0.6）。

表2 组方Ⅲ~Ⅵ各组小鼠吞噬功能、NK细胞活性与淋巴细胞刺激指数的比较Table 2 Effects ofⅢ~Ⅵ groups on the phagocytic rate, phagocytic indeх, NK cells activity and lymphocytes proliferation of immunosuppressive mice (±s, n=10)

表2 组方Ⅲ~Ⅵ各组小鼠吞噬功能、NK细胞活性与淋巴细胞刺激指数的比较Table 2 Effects ofⅢ~Ⅵ groups on the phagocytic rate, phagocytic indeх, NK cells activity and lymphocytes proliferation of immunosuppressive mice (±s, n=10)

组别 吞噬百分率/% 吞噬指数/% NK细胞杀伤活性/% 淋巴细胞刺激指数 对照组 66.43±2.12 0.71±0.03 0.72±0.02 2.01±0.08▲▲ 模型组 46.55±2.54ΔΔ 0.41±0.02ΔΔ 0.29±0.01 1.28±0.02 Ⅲ 47.66±2.35▲ 0.43±0.03▲▲ 0.35±0.02▲ 1.39±0.01▲ Ⅳ 50.30±3.04◇ 0.45±0.03◇ 0.43±0.03◇ 1.45±0.08▲ Ⅴ 48.23±2.90 0.44±0.02 0.36±0.02▲▲ 1.42±0.06▲ Ⅵ 58.08±2.42◆◆ 0.62±0.03◆ 0.71±0.02◆◆ 1.43±0.02◆◆▲

NK细胞对肿瘤细胞、病毒、胞内寄生菌都具有极强的清除作用，在抗肿瘤及免疫调节方面有重要意义。如表2所示，与模型组（0.29）相比，益生菌组（ :0.36Ⅴ ）与药食同源组方组（ :0.35Ⅲ ）NK细胞杀伤活性相近，说明益生菌与药食同源组作用相近。而药食同源组方（ :0.35Ⅲ ）和（ :0.43Ⅳ ）使小鼠NK细胞活性明显升高（P＜0.05），说明药食同源改良多肽组作用明显；同时益生菌与药食同源联用组（ :0.71Ⅵ ）的NK细胞活性超过其它组，说明益生菌在自身肠道免疫作用基础上，进一步发挥作用，促进药食同源组的物质吸收及代谢，达到协同增效的作用，共同增加NK细胞的杀伤活性，清除作用，共同起到免疫增强作用。刘红萍等[20]研究发现白芷多糖对免疫抑制小鼠NK细胞杀伤活性具有明显增强作用（0.53），且杀伤活性高于组方Ⅲ~Ⅴ，却低于组方Ⅵ（ :0.71Ⅵ ），也表明Ⅵ对肠道与机体免疫同时进行调节，促进药食同源组方代谢吸收，因此NK细胞杀伤活性更显著。各组方（Ⅲ~Ⅵ）针对NK细胞活性具有不同程度增强作用，为临床免疫及肿瘤治疗提供有力的理论依据。

2.3 药食同源组方对免疫功能低下小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

由表2可知，与空白对照组（2.01）相比，模型组小鼠T淋巴细胞增殖反应（1.28）显著下降（P＜0.01）。与模型组相比，Ⅵ组小鼠淋巴细胞增殖反应均不同程度提高Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组小鼠淋巴细胞增殖反应均不同程度提高（1.39、1.45、1.42、1.43）（P＜0.05），但都低于空白对照组。同时四组之间数据（Ⅲ~Ⅵ）差异不显著，尤其益生菌与药食同源联合使用组（Ⅵ），未见其水平优于其它三组，说明对脾淋巴细胞增殖并未起到协同增效的作用。将以上实验数据与刘红萍等研究的白芷多糖（2.10）数据相对比[20]，Ⅲ~Ⅵ组刺激指数都低于白芷多糖组，表明不同物质促淋巴细胞增殖能力显著不同，这与药食同源组方的多靶点作用有着一定关系。

2.4 药食同源组方对免疫功能低下小鼠血清免疫球蛋白的影响

免疫球蛋白IgG、IgA和IgM为体内含量最多的免疫球蛋白，反映体液免疫功能[21]。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒等免疫活性作用；IgG还可以引起细胞毒作用而杀死肿瘤细胞；IgA在血清中含量仅次于IgG，对经黏膜途径感染的病原体具有免疫抵抗作用；IgM是受抗原刺激后最先产生的抗体，具有较强的杀菌和抗病毒等免疫活性[22,23]。如表3所示，与空白组（261.21、42.56、103.22 mg/L）相比，模型组小鼠血清IgG、IgA和IgM质量浓度明显降低（126.26、16.65、73.27 mg/L）（均P＜0.01）。与模型组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组小鼠血清IgG（156.83、224.21、163.21、253.35 mg/L）、IgA（20.04、34.86、22.09、41.17 mg/L）和IgM（77.45、84.01、78.23、100.28 mg/L）质量浓度均不同程度提高（P＜0.05）。其中Ⅵ号组方免疫球蛋白提高水平明显优于其余Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号水平，其中益生菌组Ⅴ也起到一定促进免疫球蛋白水平增加作用。综上说明肠道益生菌通过定植肠道，起到促进免疫球蛋白水平增加作用，同时益生菌促进药食同源组多种有益物质吸收代谢，增强药食同源组免疫作用，共同起到协同增效作用。石惠芳等[24]采用益生菌发酵胡萝卜水溶多糖（YH）调节小鼠免疫功能，研究结果与联合组Ⅵ号比较，IgG质量浓度：Ⅵ（253.35 mg/L）＜YH（1 360 mg/L）；IgA质量浓度：Ⅵ（41.17 mg/L）＞YH（16.94 mg/L）；IgM质量浓度：Ⅵ（100.28 mg/L）＞YH（12.97 mg/L）；以上数据说明不同物质作用靶点不同，对不同类型免疫球蛋白生成水平影响亦明显不同，导致免疫功能作用也明显不同。

表3 组方Ⅲ~Ⅵ对免疫力低下模型小鼠血清免疫球蛋白的影响Table 3 Effects of Ⅲ~Ⅵ groups on IgG, IgA and IgM production of immunosuppressive mice (±s, n=10)

表3 组方Ⅲ~Ⅵ对免疫力低下模型小鼠血清免疫球蛋白的影响Table 3 Effects of Ⅲ~Ⅵ groups on IgG, IgA and IgM production of immunosuppressive mice (±s, n=10)

组别 IgG质量浓度 /(mg/L) IgA质量浓度 /(mg/L) IgM质量浓度/(mg/L) 对照组 261.21±32.53 42.56±5.82 103.22±4.34 模型组 126.26±19.04 16.65±4.54 73.27±6.03 Ⅲ 156.83±20.32▲ 20.04±6.09▲▲ 77.45±9.03▲ Ⅳ 224.21±26.63◇ 34.86±5.42◇ 84.01±3.65◇◇Ⅴ 163.21±23.12 22.09±8.01 78.23±5.55 Ⅵ 253.35±23.42◆◆ 41.17±3.28◆ 100.28±8.87◆◆

3 结论

目前实验研究中多用到的免疫抑制模型有辐射损伤模型、免疫抑制剂损伤模型和基因敲除模型；其中免疫抑制剂环磷酰胺（CTX）模型最为常见。本文旨在研究药食同源组方与益生菌联合使用，观察对CTX诱导免疫低下小鼠免疫功能的调节作用。以腹腔注射CTX建立小鼠免疫低下模型，研究组方Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ对小鼠胸腺指数、脾脏指数、吞噬能力、脾淋巴细胞增殖以及血清中IgG、IgA和IgM生成水平的影响。CTX小鼠免疫低下模型中，免疫器官胸腺和脾脏细胞受到损伤，导致模型组小鼠的胸腺指数、脾脏指数、吞噬能力、脾淋巴细胞增值能力明显低于于正常对照组，用组方（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）对免疫功能低下小鼠灌胃14 d后，小鼠胸腺指数和脾脏指数升高效果显著，NK细胞活性增强，巨噬细胞吞噬功能增强，同时对脾淋巴细胞具有明显增殖作用，促进淋巴细胞免疫效应。脾淋巴细胞增殖能力结果说明，益生菌（Ⅴ）与药食同源组方（Ⅲ和Ⅳ）相比，统计学无显著差异。免疫球蛋白检测结果显示，药食同源组方Ⅲ和Ⅳ均有显著增强血清中IgG、IgA和IgM的作用；对比Ⅲ和Ⅳ，表明小分子活性肽有利于机体吸收，Ⅳ尤其适合体质虚脱机体使用，因此Ⅳ作用更明显。益生菌对肠道具有调节作用，可缓解如肿瘤病人长期服用抗生素引起的肠道紊乱，更有利于药食同源组方发挥作用；因此药食同源组方与益生菌联合使用组（Ⅵ）提高免疫球蛋白IgG、IgA和IgM效果尤其显著。综上所述，组方Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ可提高免疫低下小鼠的非特异性和特异性免疫功能，本研究可为药食同源组方与益生菌免疫增强剂的开发提供理论依据。