液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱非靶向筛查玉米粉和小麦粉中35种真菌毒素

张淑霞，刘胜男，祝伟霞，封 琳，田 亚，宋丽亚，邢荣花

(郑州海关技术中心，郑州 450000)

随着检测技术的发展，真菌毒素的检测方法和手段越来越多。目前有关粮食及其制品中真菌毒素的检测主要有光谱法、酶联免疫法(ELISA)、胶体金快速检测法、高效液相色谱法(HPLC)[1-5]等。本研究采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道离子阱质谱法建立小麦粉和玉米粉中35 种典型真菌毒素的筛查方法，采集了标准物质化合物色谱信息，通过高分辨质谱正负离子切换FullMS/ddMS2扫描方式分析，获得多种真菌毒素的保留时间、一级母离子和二级碎片离子精确质量数，建立了35种真菌毒素标准数据库，并完成裂解途径解析与特征碎裂片段筛选； 采用数据非依赖扫描，获取可追溯的样品质谱信息，建立非定向筛查方法。该方法具有前处理简单、检测时间短、灵敏度和准确度高的优势，适用于大批量粮食及其制品中多种真菌毒素的快速筛查。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

Milli-Q超纯水净化系统，美国Millipore公司； Hettich Rotofix 32A离心机，德国Hettich公司；S10H型超声波清洗器，德国Elma公司；Heidolph multi reax多功能振荡器，德国 Heidolph公司；液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱(HPLC-Q-Exactive配Ultimate 3000液相色谱)，美国Thermo Fisher公司。

1.2 试剂与材料

甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国 ACS 恩科化学公司)；乙酸铵(色谱纯，美国ThermoFisher Scientific公司)；35种真菌毒素混合标准储备液(浓度均为10 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司)(表1)。玉米、小麦粉，购于当地农贸市场或超市。

表1 35种真菌毒素标准数据库信息

1.3 方法

称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸(84:15:1)混合提取溶液，超声提取10 min，加入3 g无水硫酸镁、1 g氯化钠涡旋振荡1 min，4 000 r/min离心5 min，移取4 mL上层溶液至试管，在40℃水浴下氮气吹干，最后加入1 mL甲醇-水-甲酸(30+70+0.1)超声溶解1 min，涡旋振荡1 min，过0.22 μm有机系微孔滤膜，供HPLC-Q/Exactive测定。

1.4 基质匹配溶液的配制

按照样品的前处理方法处理2种不同基质的空白样品，得空白基质溶液，取混合标准储备液，用空白基质溶液将其逐级稀释，得到混合标准曲线溶液。

1.5 分析条件

1.5.1 色谱条件 35种真菌毒素依据其化学性质在正、负离子模式下同时进行数据采集，色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18 SB色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温：35℃；流动相A为0.1%(体积分数)甲酸-1 mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B为甲醇。色谱梯度为：0～2 min，10% B相；2～4 min，10% B～20% B相；4～5 min，20% B～26% B相；5～7 min，26% B相；7～10.5 min，26% B～60% B相；10.5～13.5 min，60% B相；13.5～14.5 min，60% B～95% B相；14.5～17 min，95% B相；17～18 min，95% B～10% B相；18～21 min，10% B相。流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL。

1.5.2 质谱条件 喷雾电压：3 500 V；毛细管温度：320℃；离子源加热温度：300℃；鞘气流量：30 Arb，辅助气流量10 Arb；质谱扫描模式：Full MS/ddMS2(TopN)；全扫描分辨率：70 000 FWHM；AGC target：3e6；一级Maximum IT：100 ms，扫描范围：70～800 m/z；二级分辨率：17 500 FWHM；AGC target：1e5；TopN：5；进样时间50 ms；当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值2e4时，即送往高能碰撞解离碰撞池(HCD)进行碰撞，碰撞池能量分别为17.5、35.0、52.5 eV。

1.5.3 数据分析 对质谱采集到的原始.RAW图谱文件，采用XCaliber 2.0、TraceFinder 3.1数据处理系统和Msaa Frontier 7.0软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

甲醇和乙腈是目前常用的提取溶剂，由于甲醇溶解性强，易将样品中的酸、蛋白、脂肪等物质提取出来，而乙腈对不同极性的真菌毒素均有较好的溶解性，且其可沉淀蛋白，共提物较少，因此选用乙腈作为提取剂。由于35种真菌毒素大部分为中性和酸性物质，提取溶液的pH值会影响真菌毒素的解离状态，进而影响其回收率，加入1%甲酸能抑制待测酸性物质离子化使其更多地溶于有机相，同时考虑真菌毒素的极性问题，选择乙腈:水:甲酸(84:15:1)作为提取溶剂。

2.2 质谱条件的优化

配制35种真菌毒素混合标准工作液，采用高分辨质谱正负离子切换FullMS/ddMS2扫描方式分析，根据目标物分子式在正负模式和不同加合方式下分别计算精确质量数，提取离子色谱图，比较待测物在正负离子模式下的响应强度和不同加合方式下的响应强度。研究发现，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在负离子模式下响应高，母离子均为[M-H]-；T-2毒素、HT-2毒素、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、蛇形菌素和新茄病镰刀菌烯醇在正离子模式下响应高，母离子为[M+NH4]+；疣孢青霉原和T-2三醇的母离子为[M+Na]+；其余目标物则均为[M+H]+模式信号更强。选择质谱信号响应最佳的加合离子作为定量离子进行分析，通过综合考虑母离子精确质量数、保留时间和二级碎片离子等相关信息进行筛查确证，母离子峰面积定量，确保定性定量结果的准确性，35种真菌毒素相应的提取离子色谱图见图1。

图1 35种真菌毒素提取离子色谱图

2.3 二级碎片离子的选择

将从ChemSpider化学数据库官网上下载的35种真菌毒素的结构式导入Mass Frontier 7.0软件进行模拟碎裂，研究其碎裂机理，并将结构与采集的目标物的二级碎片进行匹配，选择质荷比较大且响应较高的碎片离子为35种真菌毒素的特征碎片离子。以黄曲霉毒素G2为例，该化合物的裂解过程主要为电荷中心诱导的键断裂(i断裂)、电子迁移反应和远端重排反应(rHR)，脱去1个O后形成m/z313.070 66的碎裂片段(图2)。图3为采集的黄曲霉毒素G2的二级质谱图，红色代表由Mass Frontier预测的碎片匹配，因此选取m/z313.070 41、m/z285.075 47和m/z245.080 81为其特征碎片离子。

图2 黄曲霉毒素G2的部分碎裂途径及其产生的碎裂片段

图3 黄曲霉毒素G2的二级碎片离子与预测生成的碎片离子匹配图

2.4 数据库的建立及筛查确证方法参数设定

配制质量浓度为500 μg/L的35种真菌毒素混合标准工作液，采用Full MS/dd-MS2扫描模式采集真菌毒素标准品的质谱图，通过一级全扫描模式确定待测物母离子的精确质量数和保留时间，同时通过自动触发，设定3种不同碰撞能对强度大于2e4的母离子进行碰撞，获得丰富的二级碎片离子的质荷比信息，构建了目标物的筛查谱库，在本实验仪器条件下35种真菌毒素标准数据库信息见表1。

2.5 定性分析与筛查结果判断

采用1.3的实验方法进行样品测定，在5 ppm质量窗口范围内进行化合物提取，当满足母离子精确质量数的质量偏差≤5×10-6、碎片离子精确质量数的质量偏差≤10×10-6、保留时间偏差≤30 s、目标物信号响应S/N≥3、目标物同位素丰度比偏差≤30%，且二级谱图和高分辨质谱数据库相比，可以匹配上一级母离子和至少一个二级碎片离子等条件，且无空白基质干扰，则可判断样品中可能检出目标物。以脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛查为例，其提取离子流色谱图见图4A，由该图可知脱氧雪腐镰刀菌烯醇的精确质量数偏差<5 ppm，保留时间偏差为3.6 s。母离子同位素分布见图4B，同位素比值与脱氧雪腐镰刀菌烯醇理论同位素分布匹配度为100%。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的3个二级碎片离子精确质量误差小于0.000 01Da，结果见图4C。由此判断样品中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

图4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛查分析图

2.6 定量分析方法的验证

方法以母离子作为定量离子，空白基质标准曲线外标法定量。用基质空白溶液逐级稀释标准溶液至仪器能够检出的最低浓度为方法的检出限，如表2所示，35种真菌毒素在各自线性浓度范围内线性良好，相关系数R2均大于0.99，其检出限满足我国真菌毒素限量规定指标。选择玉米粉和小麦粉的空白样品，分别添加20 μg/kg浓度水平的标准溶液，按照样品处理方法进行3次重复性试验，回收率在60.1%～115.6%之间，变异系数在1.6%～18.2%之间，真菌毒素的回收率和变异系数均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求。

表2 35种真菌毒素的线性范围、检出限、相关系数、平均回收率及相对标准偏差(n=3)

2.7 实际样品测定

采用所建立的方法筛查10个不同品种的玉米粉和小麦粉中的真菌毒素，其中4个样品检出了伏马毒素B1，含量为17～417 μg/kg，其中3个样品还同时检出了伏马毒素B2和伏马毒素B3，含量均约为33 μg/kg；10个样品均检出了脱氧雪腐镰刀菌烯醇，含量为17～220 μg/kg，4个样品同时检出了15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇和3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇，含量为3～28 μg/kg，1个样品检出了玉米赤霉烯酮，含量约为6.8 μg/kg，其余真菌毒素均为未检出。检测结果提示，市售的玉米粉和小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率较高，但小于GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定的限量值，但仍应给予持续关注。

3 结论

本研究构建了玉米粉和小麦粉中35种真菌毒素的筛查数据库，建立了基于液相色谱-四极杆/轨道阱质谱技术同时测定玉米粉和小麦粉中35种真菌毒素的筛查确证和定量分析方法。与传统的液质联用方法相比，本文建立的方法可实现正负离子模式同时扫描，具有分析速度快、灵敏度高、质量精度高的特点，且方法线性范围、检出限、回收率及精密度满足标准要求，可用于多种真菌毒素的筛查确证和定量检测，为真菌毒素污染风险监测和评估提供有效的技术支撑。