氨基酸同时消除甲醛和乙二醛的机理及消减产物的细胞毒性

林佳钰，黄才欢，郑 洁,2，刘 付，欧隽滢，周 华，胡嘉漫，欧仕益,2,*

（1.暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.焙烤食品安全粤港联合创新平台，广东 广州 510632；3.暨南大学食品安全与营养研究院，广东 广州 510632）

甲醛已被国际癌症研究机构定义为人类和动物的第一类致癌物，对人体具有巨大的危害。它能够通过外源性和内源性产生。外源性甲醛主要来源于环境和膳食暴露。环境暴露主要包括烟雾、工业污染、汽车尾气、生物质燃烧、化妆品、实验室和医院使用的防腐剂等[1]。在食品加工过程中，甲醛也可通过多不饱和脂肪酸氧化、甘氨酸的斯特勒克降解[2]、丙酮醛和乙二醛的降解[3]而产生。内源性甲醛可通过甲醇的氧化而产生。甲醇能通过水果和植物果胶中的甲酯产生，甲醇在体内被迅速吸收并代谢成甲醛。在细胞内，甲醛也可通过叶酸衍生物的分解、蛋白质和核酸的去甲基化而产生[1]。因此，甲醛广泛存在于热加工食品及水果、蔬菜、蘑菇、肉类和鱼类等食品原料中。橙子、火腿、蘑菇和马铃薯块茎中的甲醛含量分别为56.9、293、188、16.5 mg/kg[4-6]。甲醛的亚慢性毒性阈值（以最低基准质量为10%计算）是2800 μg/（kg·d），为其每日容许摄入量（acceptable daily intake，ADI）的19 倍。因此，甲醛清除剂的开发已成为近年来的研究热点[7]。

乙二醛、丙酮醛和3-脱氧葡萄糖酮等二羰基化合物易诱发体内活性氧产生，引起细胞损伤、细胞凋亡，与生物大分子如蛋白质、DNA等发生不可逆的结合等[7]。同时是晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）形成过程的中间产物。AGEs已被证明与许多慢性疾病，如葡萄糖性视网膜病变、神经病变、糖尿病和肾病等有关[9]。乙二醛与甲醛一样，能够通过外源性和内源性产生。外源性乙二醛的主要来源有环境污染和膳食摄入。环境污染主要包括烟雾、居民原木火灾、汽车尾气等[10]。在不同的食品，如发酵食品（啤酒、葡萄酒、酸奶、豆酱等）、热加工食品（面包、曲奇、咖啡和薯条等）、新鲜产品（豆类、果蔬、鱼类）以及油中均存在乙二醛[11-13]内源性乙二醛可通过碳水化合物和抗坏血酸的自氧化、糖化蛋白的降解和脂质过氧化产生[14]。乙二醛的平均暴露量为1000 μg/（kg·d），是其ADI值的5 倍[15]。

甲醛和乙二醛是两种很活泼的醛，在热加工过程中形成后迅速消失。Nowshad等[16]发现土豆块茎因自身生化代谢产生16.5 mg/kg甲醛，Bastos等[17]研究表明油炸油（菜籽油）中甲醛含量达到250 mg/kg，但Wang Wenli等[18]在油条中却检测不到甲醛（检测限0.58 nmol/L）。Gobert等[19]采用赖氨酸与葡萄糖在50 ℃反应7 d，测出添加邻苯二胺捕捉时的乙二醛浓度为3.3 mmol/L，而不添加邻苯二胺捕捉时乙二醛浓度为0.06 mmol/L，乙二醛的形成量是其终产物中残留量的55 倍。说明在热加工过程中，甲醛和乙二醛通过一些消减途径而消失了。近年来国内外研究表明，氨基酸在甲醛和乙二醛的消除中发挥重要作用。一些氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸等在室温下对甲醛的消除效果可达到40%以上[20]，其机理是氨基酸的亲电基团如巯基、氨基与甲醛易发生亲核加成反应[20]。乙二醛是美拉德反应的中间产物，与氨基酸发生亲核加成反应后，发生Strecker反应，是食品中风味物质如呋喃、吡嗪、吡啶等形成的主要途径[22]。但乙二醛等二羰基化合物也与氨基酸反应生成AGEs。Jiang Kaiyu等[23]通过模拟胃肠道消化过程研究几种蛋白质对几种活泼羰基化合物如丙烯醛、乙二醛和丙酮醛的消除作用，发现蛋白质的摄入对几种活泼羰基化合物具有较好的消除效果，并通过实验证明了蛋白质的水解产物氨基酸能够降低活泼羰基化合物的含量，且消减产物降低了丙烯醛的细胞毒性。Hu Jiaman等[24]表明甲醛和丙酮醛通过与甘氨酸、丝氨酸结合之后形成咪唑盐而降低了对正常胃上皮细胞GES-1和结肠癌细胞Caco-2的细胞毒性。但目前对氨基酸同时消除乙二醛和甲醛的机理还有待研究。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中。GABA是一种新资源食品，已被广泛应用于医药和功能性食品开发中，它在治疗癫痫、精神分裂症、抑郁症、失眠、高血压等哺乳动物疾病中发挥着重要作用，它的存在将提高益生元在降低糖尿病患者高血压方面的潜在能力[25]。L-丙氨酸（L-alanine，Ala）是一种非必需氨基酸，已被GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》列为一种食品添加剂，广泛用于食品增味。丙氨酸-谷氨酰胺可作为肠外营养改善慢性阻塞性肺病急性加重期合并II型呼吸衰竭患者的营养状况、肺功能及生活质量[26]。本研究基于甲醛和乙二醛广泛存在于食品中的实际，研究GABA和Ala同时消除甲醛和乙二醛的效率及其消除机理，揭示食品加工过程中甲醛和乙二醛的消减途径；同时，测定消减产物在食品中的含量和细胞毒性，以期为控制食品中的甲醛和乙二醛毒性提供一种新策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙二醛（质量分数40%） 上海麦克林生化科技有限公司；甲醛（质量分数37%）、盐酸（质量分数37%）天津大茂化学试剂厂；GABA（纯度99%）、Ala（纯度99%）、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）（分析纯） 北京百灵威科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国默克试剂有限公司；氘代甲醇 美国Cambridge Isotope Laboratories公司；A-HG型十八烷基键合硅胶（octadecylsilyl，ODS）日本东京YMC有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪、LC-MS8045三重四极杆液质联用仪（配有电喷雾离子源） 日本岛津仪器公司；N-1300型旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；SHA-BA恒温振荡器 江苏省金坛市医疗仪器厂；X500RQTOF型高分辨质谱仪 美国SCIEX公司；HR-200分析天平 日本A&D公司；600 MHz Avance III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪瑞士布鲁克公司；Scientz-10N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；WA-BYM-15SFT压面机 江苏无锡市麦威电器有限公司；RJ-81型油炸锅 广州佛洛丽斯厨具设备有限公司；XW-80A型微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；5804-R型离心机 艾本德中国有限公司；MB-580型酶标仪 深圳汇松科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA和Ala对乙二醛和甲醛的清除作用

分别设置甲醛对照组：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL甲醛和2 mL去离子水；乙二醛对照组：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL去离子水；实验组：于10 mL具塞比色管中，分别加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL甲醛。其中，氨基酸浓度为200 mmol/L，甲醛和乙二醛浓度均为40 mmol/L，在95 ℃条件下反应4 h。

反应结束后，参照Jiang Kaiyu等[23]的检测方法，以DNPH检测反应体系中剩余的甲醛和乙二醛含量。具体检测方法如下：将反应后溶液稀释100 倍后，取0.2 mL于5 mL试管中，再加入1 mL DNPH（6 mmol/L，V乙腈/V水=9∶1，采用10%盐酸将pH值调为2）和1.8 mL乙腈，在70 ℃衍生2 h。衍生后样品经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪（配有SPDM20A光电二极管阵列检测器）检测。具体检测条件参照胡嘉漫等[27]的方法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为水-乙腈（30∶70，V/V），进样体积5 μL，流速0.6 mL/min，柱温40 ℃；检测波长353 nm（甲醛衍生物）和425 nm（乙二醛衍生物）。甲醛和乙二醛均以标准物质衍生后进样，每个样品采用3 次平行测定，以浓度和峰面积绘制标准曲线，以标准曲线计算得出样品中甲醛和乙二醛的残余量。

1.3.2 消减产物的分离纯化

分别称取GABA/Ala、甲醛和乙二醛于装有20 mL去离子水的100 mL三角瓶中，其中氨基酸浓度为0.5 mmol/L，甲醛和乙二醛浓度为0.1 mmol/L。于95 ℃反应10 h。反应结束后，采用旋转蒸发仪将反应液浓缩至1～2 mL，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，用胶头滴管加到平衡好的反相硅胶层析柱（ODS填料）上，进行柱层析分离。玻璃层析柱规格为25 mm×600 mm，反相硅胶柱填料体积为200 mL。分离方法参考邹照佳等[28]，用体积分数5%甲醇溶液平衡柱子后，湿法上样，以5%甲醇溶液等度洗脱150 mL后开始收集样品，流速为3 s/滴，馏分体积为5 mL。各馏分液经0.45 μm微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪测定消减产物的纯度。色谱柱为ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水（含0.1%甲酸）-甲醇（95∶5，V/V），进样体积1 μL，流速0.6 mL/min，柱温40 ℃；检测波长208 nm。收集高纯度馏分并冷冻干燥48 h，获得消减产物固体。

1.3.3 消减产物的结构鉴定

将纯度大于95%的馏分，采用高分辨质谱仪获得消减产物的精确分子质量。取20 mg固体样品溶于550 μL氘代水中，采用NMR仪获得目标产物的一维谱图（1H NMR、13C NMR、Dept-135NMR）和二维谱图（HMBC、HSQC、H-H COSY）。

1.3.4 饼干和油炸薯片的制备

饼干配方参考翁婷等[29]的方法，先将烘焙细砂糖、碳酸氢钠、碳酸氢铵和氯化钠放入盆中，称取GABA和Ala。GABA和Ala添加量均为1.5 mg/kg，分别作为GABA对照组和Ala对照组，同时设置空白组，不添加氨基酸。再用16 g的水少量多次溶解后，与之前准备的原料混合搅拌均匀。待油融化后加入原料迅速搅拌均匀，加入面粉混合均匀制成面团。用压面机辊压2 次，制成饼干后放在吸油纸上，置于提前预热30 min的烤箱中，在165 ℃加热15 min后放置在干燥器中保存。

油炸薯片制备参考郭鸿阳等[30]方法，将沥干的马铃薯切片在165 ℃的花生油中油炸3 min后将其取出，沥干油渍，冷却至常温后装入密封袋置于干燥器中保存。

1.3.5 食品体系中消减产物含量的测定

食品样品选自1.3.4节制备得到的饼干及薯片，以及两种市售饼干和薯片，饼干和薯片的主要原材料分别为小麦粉和马铃薯。将10 g食品样品碾碎后，取3.0 g于50 mL离心管中，加入5 mL正己烷涡旋5 min后，在10000 r/min离心10 min，去除上清液，此过程重复2 次，于通风橱中将残余正己烷过夜挥干。加入15 mL 20%甲醇溶液，涡旋5 min后于10000 r/min离心10 min，此过程重复2 次，收集上清液后浓缩定容至5 mL，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱-串联质谱的多反应监测模式对消减产物进行测定，每个样品重复3 次。测定参数：色谱柱为ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水（A，含0.1%甲酸）和甲醇（B），流动相条件为：0～2 min，95%～5% A、5%～95% B；2～8 min，5% A、95% B；8～10 min，5%～95% A、95%～5% B；10～18 min，95% A、5% B。进样量0.5 μL，流速0.4 mL/min。以正离子模式运行，离子源为电喷雾离子源，扫描范围m/z0～800；离子源温度300 ℃，去溶剂化温度250 ℃，毛细管电压4000 V，扫描速率1000 Da/s。GABA和Ala来源的消减产物质谱参数如表1所示。

表1 两种消减产物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for two reaction products

1.3.6 细胞毒性实验

MTT法分别检测甲醛、乙二醛、甲醛和乙二醛的混合物，以及两种消减产物对人正常胃上皮细胞（GES-1）的毒性。GES-1采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。待细胞生长至汇合率为80%左右时，加入1.5 mL胰酶消化成单细胞悬液，显微镜下计数后，向96 孔细胞培养板中（除外周36 孔）中加入100 μL细胞数5000 个/mL的单细胞悬液。置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养6～24 h，使细胞贴壁生长。分别加入100 μL不同浓度的药物孵育细胞。GABA或Ala咪唑盐、乙二醛浓度均为0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L，甲醛浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L，混合醛中甲醛、乙二醛浓度均为0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。在培养箱中培养24 h后，移除孔板中的培养基和药物，加入100 μL含0.5% MTT的培养基替代药物，37 ℃继续培养4 h后终止培养，移除培养基，加入150 μL/孔二甲基亚砜溶液，使用酶标仪振荡后，于570 nm检测吸光度。每个浓度重复3 次，细胞存活率表达均为。

1.3.7 细胞活力计算

式中：A1为药物组的吸光度；A2为对照组的吸光度。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 氨基酸对甲醛和乙二醛的消除作用

利用DNPH作为衍生剂检测甲醛和乙二醛残余量，以此评价氨基酸对甲醛和乙二醛的消除效果。分别在生理温度（37 ℃）和95 ℃研究GABA和Ala对甲醛和乙二醛的消除效果，发现低温下两种氨基酸对甲醛和乙二醛的消除效果不高，所以本研究重点探讨95 ℃条件下GABA、Ala对甲醛和乙二醛的消除作用及其机理，消除效果如表2所示。结果表明，在混合醛体系中，GABA对乙二醛的消除效果从55.84%上升至70.64%，Ala对甲醛的消除效果从2.68%上升至41.33%。此外，GABA对甲醛具有较好的清除效果，可以达到84.31%。Ala对乙二醛的消除效果略低于GABA，只有45.90%。这说明，在混合醛体系中，GABA或Ala能够与一部分的甲醛和乙二醛反应从而达到同时消除甲醛和乙二醛的目的。

表2 GABA和Ala对甲醛和乙二醛的消除率（95℃、4 h）Table 2 Removal rates of formaldehyde and glyoxal by reaction with GABA or Ala at 95℃ for 4 h

2.2 消减产物的分离纯化

95 ℃水浴反应4 h后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消减产物的高效液相色谱图如图1所示。产物中除了氨基酸之外，还出现了一个峰面积较大的新产物。GABA与甲醛、乙二醛的消减产物的出峰时间为7.950 min；Ala与甲醛、乙二醛的消减产物的出峰时间为6.909 min。

图1 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消减产物的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the reaction products from GABAformaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal systems (B)

根据前期研究，反相硅胶能较好分离氨基酸消除丙烯醛、丙酮醛和甲醛后形成的产物（胡嘉漫[27]、邹照佳[28]）。因此，本研究采用反相硅胶分离、甲醇洗脱、茚三酮（与氨基酸反应显色）监测，判断消减产物流出时间，并采用高效液相色谱测定其纯度，收集纯度大于95%的馏分，如图2所示。

图2 GABA-甲醛-乙二醛（A）与Ala-甲醛-乙二醛（B）纯化消减产物的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the purified reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

经紫外全波长扫描后，GABA与甲醛、乙二醛的消减产物最大吸收波长为200 nm；Ala与甲醛、乙二醛的消减产物最大吸收波长为209 nm，如图3所示。

图3 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消减产物的全波长扫描图Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.3 消减产物的结构鉴定

纯化后的消减产物经高分辨质谱仪检测后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消减产物的相对分子质量分别为240.1183和212.0870，分子式分别为C11H16N2O4和C9H12N2O4，如图4所示。

图4 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消减产物的高分辨质谱图Fig.4 High-resolution mass spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

GABA-甲醛-乙二醛消减产物的NMR归属如表3所示。结果表明，该消减产物为1,3-双(3-羧丙基)咪唑。

表3 GABA-甲醛-乙二醛消减产物的NMR归属Table 3 NMR spectral assignments of the reaction product from GABA-formaldehyde-glyoxal system

Ala-甲醛-乙二醛消减产物的NMR归属如表4所示。结果表明，该消减产物为1,3-双(1-羧乙基)咪唑。

表4 GABA-甲醛-乙二醛消减产物的NMR归属Table 4 NMR spectral assignments of the reaction product from Ala-formaldehyde-glyoxal system

根据以上研究结果，推测其反应机理如图5所示，与氨基酸-甲醛-丙酮醛互作机理[27]相似：GABA或Ala与甲醛生成不稳定的中间产物Mannich碱，由于N原子的吸电子效应，导致α-C上正电荷堆积，另一分子的GABA或Ala易与之发生亲核加成反应形成一个中间产物。中间产物上的两个亚氨基与乙二醛的两个羰基发生亲核加成后生成一个五元环结构，再脱去两分子的水，形成咪唑盐。

图5 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消减产物的形成机理Fig.5 Formation mechanism of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.4 食品样品中消减产物的含量

GABA广泛存在于动植物体内，马铃薯粉中含有丰富的游离氨基酸，Elmore等[31]测得马铃薯粉中GABA含量仅次于天冬酰胺，高达665 mg/kg。张志清等[32]通过高效液相色谱法测得不同的小麦品种中GABA含量为2.38～52.59 mg/kg。丙氨酸在马铃薯粉中的含量高达259 mg/kg[31]，同时也是小麦中的一种主要氨基酸[33]。为此，采用制备的咪唑盐标准样品，建立高效液相色谱-串联质谱法检测了两种市售油炸薯片（复合薯片）和饼干中咪唑盐含量，其中油炸薯片中GABA、Ala咪唑盐含量分别为（188±8）μg/kg和（156±1）μg/kg，饼干分别为（149±23）μg/kg和（27±4）μg/kg。

同时，实验检测自制的鲜切油炸薯片和饼干中的咪唑盐含量，结果表明，鲜切油炸薯片中GABA、Ala咪唑盐含量分别为（2666±218）、（855±91）μg/kg，均高于自制饼干中的GABA、Ala咪唑盐含量，说明薯片中有更多的GABA和Ala与甲醛和乙二醛结合生成了咪唑盐，推测可能与原材料中氨基酸的含量有关。为此，在制作饼干时分别添加了1.5 mg/kg的GABA和Ala（即16.9 μmol/kg和14.6 μmol/kg），发现GABA和Ala的添加使两者的咪唑盐含量分别从（705±66）μg/kg和（67±3）μg/kg增加到（1883±16）μg/kg和（616±38）μg/kg。GABA、Ala咪唑盐的相对分子质量分别为240和212，氨基酸添加后，咪唑盐含量分别增加了4.9 μmol/kg和2.6 μmol/kg，即两种氨基酸对甲醛和乙二醛的消除率分别达到34%和15%。在乙二醛和甲醛（与氨基酸物质的量比为1∶1∶5）同时存在的模拟体系中（表2），GABA对甲醛和乙二醛的消除率分别为16.7%和14%，Ala对甲醛和乙二醛的消除率分别为8.3%和9.2%（物质的量比）。说明在焙烤温度更高的饼干（165 ℃）中，两种氨基酸对甲醛和乙二醛的消除率高于模拟体系。

2.5 消减产物的细胞毒性

上述研究表明，食品中GABA与Ala可通过与甲醛、乙二醛反应形成咪唑盐而消除甲醛和乙二醛，但咪唑盐的毒性未知。胃是人体主要的消化道器官，食物经口腔、食管传递后进入胃进行储藏和消化，并存在部分吸收。本研究采用人正常胃上皮细胞探索甲醛、乙二醛和消减产物的细胞毒性。结果表明，甲醛、乙二醛和消减产物的细胞毒性存在显著差异，如图6所示。GES-1细胞活力随着甲醛浓度的增加急剧降低，在甲醛浓度为0.20 mmol/L时细胞活力仅剩下19.0%。较甲醛而言，乙二醛对GES-1细胞的毒性较低，在乙二醛浓度达到2.0 mmol/L时，细胞活力为55%。在甲醛-乙二醛混合醛体系中，GES-1细胞活力随着混合醛浓度的增加急剧降低，在混合醛浓度为0.20 mmol/L时，细胞活力仅剩下14.0%，较0.20 mmol/L甲醛处理的细胞活力更低，说明混合醛对细胞存在协同致毒效应。氨基酸与两者形成咪唑盐后，细胞毒性显著降低。Ala和GABA咪唑盐浓度为4 mmol/L时，GES-1细胞活力仍保持在97%和113%，说明在4 mmol/L下，消减产物对GES-1细胞的生长没有抑制作用。

图6 甲醛、甲醛-乙二醛混合醛（A）和乙二醛、GABA咪唑盐和Ala咪唑盐（B）对GES-1细胞活力的影响Fig.6 Effect of formaldehyde and its mixture with glyoxal (A),and glyoxal and imidazole salts formed with GABA and Ala on the cell viability of GES-1 cells (B)

3 结论

甲醛、乙二醛和游离氨基酸共存于热加工食品中。本研究表明，GABA和Ala可同时消除甲醛和乙二醛，且两种有害醛共存时对氨基酸消除它们产生一定的协同效果。氨基酸消除混合醛的机理不同于单一醛，它是两分子氨基酸分别与一分子甲醛和乙二醛反应、脱去3分子水后形成咪唑盐。咪唑盐的形成显著降低了甲醛和乙二醛的细胞毒性。鉴于咪唑盐在油炸和焙烤条件下都可形成，且添加GABA和Ala会增加饼干和油炸薯片中咪唑盐含量，说明采用氨基酸同时减控热加工食品中甲醛和乙二醛具有很好的应用前景。