剁椒姜丝后熟阶段微生物与挥发性风味物质的相关性

田叶新，母应春,*，苏 伟,2，尹学东

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省农畜产品储藏加工技术重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵三红食品有限公司，贵州 遵义 563099）

中国的辣椒产量居世界首位，辣椒中含有能够促进人体健康的化合物，如辣椒素、类胡萝卜素等[1]。剁椒姜丝（DJJS）是以辣椒和姜丝为主要原料发酵制作而成。剁椒酸辣适宜、风味醇厚，深受大众喜爱[2-3]。生姜中含有多种功能性成分，如姜辣素、姜烯酚和姜酮等酚类成分，嘌呤类化合物以及姜油等挥发油类[4-5]，其中生姜黄酮可有效抑菌[6]并且能增加产品风味。

在蔬菜的自然发酵过程中，附着在蔬菜表面的微生物在低氧环境中生长成为发酵过程中的优势微生物[7]，但此过程不可避免的会存在杂菌。将DJJS进行巴氏杀菌后装罐密封发酵，经过一段时间的贮藏达到生理上的完全成熟，此过程为后熟阶段，可有效抑制杂菌繁殖。后熟阶段的发酵制品的刺激性气味消失，取而代之的是香气浓厚、口感清爽且风味独特的产品。

目前，具有独特风味和营养的发酵制品正成为热点，但对DJJS后熟阶段微生物与挥发性风味物质的相关性研究仍是空白。如今，高通量测序技术已用于各发酵食品中微生物群落的监测[8]，因效率高、准确率高等特点被应用于微生物多样性的研究[9-11]，且常结合代谢组学以研究食品挥发性风味。杨帆等[9]采用高通量测序方法分析了不同豆瓣酱商品及农家自制豆瓣酱发酵各阶段样品的微生物多样性。Wang Jingjing等[12]利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术分析了剁椒自发发酵过程中挥发性化合物的含量。因此，通过结合代谢组学技术可全面分析传统发酵食品中微生物与风味的关系。

本研究以后熟阶段的DJJS为研究对象，利用高通量测序和HS-SPME-GC-MS分析后熟过程中微生物群落结构、挥发性风味物质及理化特性的变化，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等方法研究DJJS后熟过程中微生物群落和挥发性风味物质的相关性，旨在为DJJS的品质研究提供更有力的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用DJJS由贵州省贵三红食品有限公司生产，产品经巴氏杀菌后贮藏在37 ℃条件下加速后熟。随机选取同一批次的产品进行实验。在后熟阶段的第0、3、7、14天，分别随机取样3 罐混合均匀。无菌条件下取样10 g，用于DNA提取和高通量测序，剩余样品装入无菌袋于-80 ℃条件下贮存[13]，以供后续测定理化指标和风味成分。

氢氧化钠 重庆川东化工（集团）有限公司；酚酞、亚铁氰化钾 四川省成都金山化学试剂有限公司；乙醇、酒石酸钾钠 上海麦克林生化科技股份有限公司；硫酸铜 广东光华科技股份有限公司；乙酸锌 天津市科密欧化学试剂有限公司；动力土壤DNA分离试剂盒美国Omega BioTek公司。

1.2 仪器与设备

GeneAmp 9700 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；Nanodrop 2000超微量分光光度计、Trace1300-TSQ8000 GC-MS仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；Illumina HiSeq 2500 测序仪 美国Illumina公司；FA1004N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；SoilStik pH计 美国Spectrum公司；SX型马弗炉 江苏省无锡市华瑞普邦科技有限公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头 美国安捷伦公司；Protable refractometer手持糖度计 上海淋誉贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标测定

参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[14]、GB 12456—2021《食品中总酸的测定》[15]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[16]和GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》[17]的方法对样品水分、总酸、灰分和还原糖含量进行测定；使用pH计和手持糖度计直接测定DJJS的pH值和可溶性固形物含量。

1.3.2 细菌和真菌DNA提取和PCR扩增

使用动力土壤DNA分离试剂盒从DJJS样品中提取微生物的DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定最终DNA浓度，使用1%琼脂凝胶电泳和分光光度法（260、280 nm波长处的光密度比）分析DNA。采用引物对338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGAC-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）通过热循环PCR系统扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4高变区；用正向引物IT1F（5’-CTTGGTCATTAGGAGGAGTAA-3’）和反向引物IT1R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGGC-3’）扩增真菌的ITS1区。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 个循环，最后72 ℃稳定延伸10 min，在4 ℃保存备用。将DNA贮存在-80 ℃下，以供下一步处理。

1.3.3 高通量测序和序列分析

根据双端测序的重叠关系，用Flash v1.2.7软件对每个样品的序列进行重叠组装，得到的Mosaic序列为原始序列数据。然后，用Trimmomatic v0.33软件对拼接后的原始数据进行过滤，得到高质量的序列数据。最后，使用Uchime v4.2软件识别并去除嵌合序列，获得有效数据。使用Usearch软件，根据相似度为97%的聚类，获得样品的操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）编号。将OTU的序列与Silva（细菌）和Unite（真菌）的分类数据库进行比较，并对相应的微生物物种进行注释，比较阈值设定为70%。

1.3.4 挥发性风味化合物的提取与测定

将2.5 g样品和7 mL饱和食盐水放入20 mL顶空瓶，加入20 μL内标（20 μg/mL环己酮），用PTFE硅胶隔膜密封。将样品在40 ℃平衡20 min，并将50/30 μm CAR/PDMS/DVB涂覆的纤维导入SPME装置中，将其插入小瓶中并在60 ℃下振荡40 min以提取和吸附挥发性风味物质。使用自动进样器和进样口连接，并在240 ℃下5 min内将挥发性风味物质解吸到色谱端的色谱柱。

GC条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；高纯氦气为载气，流速1 mL/min；不分流进样；进样量为1 μL；进样口温度为240 ℃；升温程序：40 ℃保持5 min；以5 ℃/min上升到150 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度250 ℃；电离电压70 eV；传输线温度240 ℃；扫描范围m/z35～550；保留匹配度大于700的化合物。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 DJJS后熟阶段理化性质变化

后熟过程中理化指标直接反映了DJJS的发酵状态和发酵程度。如表1所示，在整个后熟阶段，DJJS的pH值均呈下降趋势（从5.26±0.07下降到4.62±0.01），总酸含量呈上升趋势（从（6.42±0.16）g/kg上升到（7.72±0.01）g/kg），与之前的研究结果变化趋势相似[18]。DJJS的pH值变化与样品中乳酸菌生长情况密切相关。后熟初期，产酸微生物生长繁殖，体系pH值开始减小，总酸含量升高；后熟中期，可能由于生姜本身含有的姜辣素、姜酮等化合物抑制了微生物生长，体系pH值下降速率降低，最终pH值和总酸变化趋于平稳。由表1可知，整个体系处于偏酸环境，这有利于抑制部分有害菌的生长，保证DJJS品质。还原糖和灰分变化趋势一致，在整个后熟阶段均无显著差异（P＞0.05）。后熟阶段的可溶性固形物质量分数在16.97%～17.40%范围内，在整个过程呈动态变化：后熟前期可溶性固形物含量差异不显著（P＞0.05）；后熟中期，可溶性固形物含量开始上升；后熟后期，由于微生物代谢活动及酶活性不活跃，导致可溶性固形物含量下降。后熟阶段产品的水分含量均无显著差异（P＞0.05）。

表1 DJJS后熟阶段的理化指标Table 1 Physicochemical indexes of chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

2.2 DJJS在后熟阶段微生物群落的多样性

2.2.1α多样性分析

对DJJS后熟阶段微生物多样性和丰富度进行测定，如表2所示，DJJS中细菌菌群的Chao1指数在后熟前期降低，主要是因为在后熟前期不能够代谢某些初级产物导致其生长受到影响[19]；后熟后期，细菌群落丰富度上升并达到最大值，此时Chao1指数为337。DJJS细菌菌群的Shannon指数随着发酵进行先下降后上升，在后熟后期达到最大值，为4.40，说明在后熟后期DJJS细菌菌群多样性最高。

表2 DJJS后熟阶段微生物群多样性和丰富度Table 2 Diversity and abundance of microbiota in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

DJJS中真菌菌群Chao1指数呈现出和细菌菌群丰富度指数一样的变化趋势，都在后熟前期表现出下降趋势，在后熟第14天达到最大值，说明在后熟后期，DJJS的细菌菌群和真菌菌群丰富度都很高，后期发酵环境适宜其优势菌群生长繁殖。DJJS中真菌菌群的Shannon指数在后熟第7天达到最大值，为3.9，说明后熟第7天的DJJS真菌多样性最高；后熟后期，DJJS真菌菌群多样性开始下降，可能是由于此时发酵环境氧气不足，而且此时pH值下降，导致不耐酸和一些腐败菌的生长受到抑制，所以造成真菌菌群多样性降低。

由图1可知，细菌和真菌稀释曲线和Shannon曲线趋于平缓，表明DJJS中的物种不会随测序数量的增多而明显增加，说明样品序列充分，可进行数据分析。

图1 细菌（a、c）和真菌（b、d）稀释性曲线和Shannon曲线Fig.1 Rarefaction curves and Shannon curves of bacteria (a and c) and fungi (b and d) in chopped pepper with shredded ginger

2.2.2 DJJS在后熟阶段微生物群落分析

测序数据在门和属两个层面进行分类，研究DJJS在后熟阶段微生物群落演替情况。如图2所示，共鉴定出5 个优势门（相对丰度＞1%），包括3 个细菌门和2 个真菌门。在细菌门水平上，细菌群落主要有变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），分别占总细菌群的91.10%、5.94%和2.44%，此结果与其他发酵制品的16S rRNA测序结果一致[19-21]。变形菌门和厚壁菌门不仅是本实验样品中的优势细菌门，也是发酵蔬菜[20]、四川泡菜[22]和小曲[23]中的优势细菌门，拟杆菌门也广泛存在于大曲中[24]，说明各发酵制品间存在共性。在真菌门上，优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），分别占总真菌群的97.61%和2.25%；在后熟阶段子囊菌门一直占据主导地位，而且随着发酵时间推移，子囊菌门的相对丰度整体呈增长趋势，到后熟后期趋于稳定。

图2 细菌（a）和真菌（b）群落结构在门水平上的相对丰度Fig.2 Relative abundance of bacterial (a) and fungal (b)communities at the phylum level

在属水平上，共检测到374 个细菌属和158 个真菌属，其中有9 个核心细菌属，11 个核心真菌属（相对丰度＞1%）。由图3可知，9 个细菌属分别是罗尔斯顿菌属（Ralstonia，56.03%）、不动杆菌属（Acinetobacter，10.43%）、肠杆菌属（Enterobacter，5.98%）、欧文氏菌属（Erwinia，4.73%）、乳球菌属（Lactococcus，2.19%）、未指明的肠杆菌科（unspecified_Enterobacteriaceae，3.33%）、假单胞菌属（Pseudomonas，2.79%）、Wautersiella（1.20%）、气单胞菌属（Aeromonas，1.12%）。11 个真菌属分别是炭疽菌属（Colletotrichum，62.46%）、青霉菌属（Penicillium，9.65%）、镰刀菌属（Fusarium，4.31%）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania，2.53%）、unspecified_Plectosphaerellaceae（2.14%）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces，1.15%）、未指明酵母菌（unspecified_Saccharomycetales，1.45%）、链格孢属（Alternaria，3.32%）、汉逊酵母属（Hanseniaspora，1.66%）、未指明的格孢腔菌属（unspecified_Pleosporales，1.75%）、枝孢属（Cladosporium，2.56%）。

图3 细菌（a）和真菌（b）群落结构在属水平上的相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial (a) and fungal (b)communities at the genus level

细菌属中，罗尔斯顿菌属和不动杆菌属在整个后熟阶段均占优势，说明罗尔斯顿菌属和不动杆菌属在DJJS的后熟阶段起着重要作用。随着发酵的进行，不动杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属和未指明的肠杆菌属增加，且均属于变形菌门，据报道杆菌属类也是米酒发酵前期主要细菌属[25]。随着发酵的进行，罗尔斯顿菌属对应呈比例下降，可能是微生物之间的拮抗作用所致。罗尔斯顿菌属从第0天的56.73%下降到第14天的52.73%，而不动杆菌属从第0天的9.46%逐渐增加至第7天的11.61%，到发酵第14天又下降到10.54%。假单胞菌属从开始发酵时的3%下降到后熟后期的2.79%，假单胞菌属不能发酵糖类物质[26]，且属于需氧菌，而DJJS后熟阶段整个发酵环境属于密闭的无氧环境，所以出现下降趋势。有研究证实了气单胞菌能够利用碳水化合物[27]，稳定存在于样品中发酵葡萄糖产酸，导致整个体系pH值呈下降趋势、总酸呈上升趋势，与本研究测定的pH值和总酸结果一致。

真菌属中，优势菌为炭疽菌属和青霉菌属，并且随着炭疽菌属的增加，青霉菌属呈现下降趋势。其中青霉菌属和各酵母属（哈萨克斯坦酵母属、德巴利氏酵母属、unspecified_Saccharomycetales和汉逊酵母属）均随着发酵时间的延长呈下降趋势。汉逊酵母属能产生乙酸乙酯增加产品香味[28]，该菌属还能与葡萄糖产生磷酸甘露聚糖，对调节食品的风味有一定作用。整个发酵体系中，酵母属占比较大，但都随发酵的进行不断减少。王雪雅等[29]的研究发现多种酵母菌会引起糟辣椒“生花”，因此，酵母菌属的减少能够避免产品出现“生花”现象。其他研究显示德巴利氏酵母属在发酵后期属于优势真菌[20,30]，而DJJS后熟后期德巴利氏酵母属却减少，这可能是原料差异及发酵环境不同所致。

2.3 DJJS挥发性风味物质分析

由表3可知，共鉴定出87 种挥发性化合物（匹配度＞700），其中烃类15 种，酸类10 种，醇类28 种，醛类3 种，酯类11 种，酮类5 种，酚类5 种，醚类3 种，萜烯类2 种和其他类5 种。其中，满足P＜0.05，变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1的挥发性风味物质为差异显著代谢物，共36 种，如图4a所示。由图4b可知，PC1和PC2分别占总方差的59.3%和22.2%；随着发酵进行，样本从第3象限顺时针移动到第4象限，且不同阶段明显分离，说明在后熟阶段，代谢产物变化非常迅速。由图4c可知，随着发酵时间的延长，挥发性风味物质种类增多，说明后期风味更丰富。

表3 DJJS挥发性风味物质种类和含量变化Table 3 Changes in the types and contents of volatile flavor substances in chopped pepper with shredded ginger

续表3

续表3

图4 DJJS后熟阶段风味代谢产物动态变化Fig.4 Dynamic changes of flavor metabolites in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

罗松明[31]的研究发现，泡姜中香气物质主要是烯烃类，本研究结果也显示烯烃类物质含量较高。这些挥发性风味物质中，榄香烯和橙花醇可能来源于生姜，其中橙花醇是玫瑰精油中的代表性成分[32]；二烯丙基二硫可能来源于大蒜挥发[11]。生姜中的姜辣素主要包括姜醇、姜酚和姜酮，与其他发酵辣椒中挥发性风味物质对比，本研究首次在剁椒中发现了表姜烯酮和束骨姜黄醇，并且束骨姜黄醇在整个后熟期呈现出持续增长的趋势，证明生姜对本产品的风味有较大贡献。含硫化合物是植物中一类特殊的天然产物，尤其是在辣椒、大蒜和洋葱中，它们会产生强烈、刺鼻和刺激性的味道，各种硫化物衍生物的形成主要受发酵条件的影响[33-34]。

醇类是微生物代谢或乙醇发酵羰基的还原机制产物，是生成长链酯类化合物的重要前体物质。高浓度的高级醇会产生强烈的刺激性气味，而低浓度时则会产生果香[22]。本研究检测到的醇类中，(-)-异蒲勒醇、菖蒲烯醇、潜育醇、α-毕橙茄醇、十七烷醇、顺式澳白檀醇和柳杉二醇随着发酵的进行含量显著升高（P＜0.05）。异蒲勒醇既是香料及化妆品工业中一种主要的原料，又是药物及天然产物合成中有用的中间体[35]，呈樟脑和薄荷香气，同时带有玫瑰叶和香茅香。α-毕橙茄醇在黄金茶和白肉苁蓉属中也被发现，且含量较高，不易挥发；并且在白肉苁蓉属的叶中，α-毕橙茄醇是主要的香味贡献物质[36-37]。柳杉二醇是抗阿尔茨海默病和抗痉挛性质的天然产物，具有显著的药用价值[38]，柳杉二醇具有凤梨果油[39]、毛竹果实油[40]、黄脉石斑鱼和金刚石斑鱼的果实油[41]等香气。

酯类通常来源于短链酸与醇的酯化反应[42]，表现出令人愉快的水果香气[43]。其中乙酸冰片酯（松树香）、癸酸乙酯（椰香）、乙酸香茅酯（柠檬果香、玫瑰香）、花生四烯酸甲酯和(E)-10-七烯-8-炔二酸甲酯在整个后熟过程均被检测到。乙酸冰片酯在后熟前期逐渐升高，在第7天达到峰值。癸酸乙酯具有强烈持久的奶油香、脂肪香及椰子香[44]，能够赋予DJJS椰香味。水杨酸甲酯有强烈的冬青油香气，只在后熟前期出现，说明水杨酸甲酯可能来源于原料，水杨酸甲酯在提供香气的同时，还可增加辣椒的抗氧化能力和降低腐烂率[45]。检测到的支链酸酯大多来源于氨基酸代谢[46]。

酮类物质含量在后熟期间几乎都呈先增后降的趋势。2-庚酮呈香蕉香气及轻微药香气味，甲基庚烯酮具有水果香气和新鲜清香香气，二者都在后熟第7天达到峰值。β-紫罗酮含量在整个后熟阶段呈上升趋势，具有紫罗兰香味，是整个过程共有的特征香气。有研究发现，β-紫罗酮能够增加样品的甜味和酸味[47]。

萜烯苷类可以水解释放出萜烯苷元，增加产品香气，后熟后期萜烯含量有所上升，这可能是因为结合的萜烯被水解生成挥发性香气化合物或在发酵过程中转化为其他化合物[48]。除此之外，在DJJS中，挥发性香气成分还有醛类、酮类、酚类、醚类和酸类等物质。山梨酸是所有检测到的挥发性风味物质中含量最多的，对霉菌、酵母菌和好氧性细菌有抑菌作用，能够延长样品的保质期。

2.4 微生物与挥发性风味化合物之间的相关性分析

对后熟阶段挥发性成分发生显著变化的物质与核心微生物进行相关分析。如图5a所示，通过O2PLS-DA模型筛选出7 个核心微生物属（VIP＞1且P＜0.05），其中真菌属4 个（青霉菌属、哈萨克斯坦酵母属、德巴利氏酵母属和炭疽菌属），细菌属3 个（罗尔斯顿菌属、肠杆菌属和欧文氏菌属），说明这7 个核心微生物属对挥发性风味有重要影响。由图5b可知，基于Pearson相关系数揭示了36 种显著差异挥发性风味物质与核心微生物之间的联系。德巴利氏酵母属与柠檬烯-6-醇、α-广藿香烯、乙酸香叶酯、2-(4-甲基-1,4-环己二烯基)-2-丙醇和邻苯二甲酸正辛酯呈高度显著正相关（P＜0.001），与伞房酮呈极显著正相关（P＜0.01）；而肠杆菌属与柠檬烯-6-醇、α-广藿香烯、乙酸香叶酯、2-(4-甲基-1,4-环己二烯基)-2-丙醇和邻苯二甲酸正辛酯呈显著负相关（P＜0.05），与伞房酮呈负相关。据报道，德巴利氏酵母属是韩国大酱中的主要酵母[49]。德巴利氏酵母产柠檬酸，能利用烷烃作碳源。酵母菌能利用碳水化合物转化为乙醇产生一系列的酸、酯和高级醇[50]。肠杆菌属和欧文氏菌属与柳杉二醇、1,2-苯二甲酸-1-丁基-2-(8-甲基壬基)酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、月桂酸、杜松醇和4,4-二甲基-3-(3-甲基-3-亚苯基-2-亚甲基双环[4.1.0]庚烷)呈正相关。因此，肠杆菌属和欧文氏菌属可能对同种风味的贡献一致，而和德巴利氏酵母属对同种风味的贡献相反。有报道显示杆菌有促进醇类物质生成的作用[51]。有研究表明，这些关系可能是由微生物之间的相互作用而不是单个属的作用引起，因此多个属可能与单一的风味化合物有关[50]，这与本研究发现一致。

图5 基于O2PLS-DA模型的DJJS后熟阶段核心微生物（a）和微生物群与挥发性风味物质的相关性分析（b）Fig.5 Determination of core microorganisms (a) and correlation analysis between microbiota and volatile flavor substances in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage based on O2PLS-DA model (b)

3 结论

揭示DJJS在后熟阶段理化特性、微生物多样性和挥发性风味物质之间的差异，采用高通量测序和HS-SPMEGC-MS对微生物群落结构和挥发性风味物质进行分析，并基于O2PLS-DA和Pearson相关系数分析挥发性风味与优势微生物的相关性。结果表明，从优势属中获得了4 种差异显著的真菌属和3 种差异显著的细菌属；从鉴定出的87 种挥发性风味物质中筛选出36 种具有显著差异的挥发性风味物质，发现德巴利氏酵母属、肠杆菌属和欧文氏菌属与多种风味物质的变化呈现出一定相关性。本研究有助于解析DJJS菌群结构对风味的形成机制，开发基于微生物调控技术的优质剁椒生产技术，提高产品风味及品质稳定性。