薇甘菊提取物抗烟草花叶病毒活性研究

张威祁进康吴江梅李晋芳胡世俊闫晓慧

(1.西南林业大学生物多样性保护学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)

植物病毒病是农业生产中常见的一种病害，被称为“植物癌症”。烟草花叶病毒(TMV)是最具代表性的植物病毒。该病毒寄主范围广泛，可侵染400多种植物，并引起重大病害[1]，常见于茄科植物中，最容易为害烟草和番茄。TMV侵染植物后叶片呈花叶和坏死斑，造成植株畸形、矮化，甚至死亡，导致农作物大幅度减产[2]。已有研究表明，多种植物提取物具有良好的抗TMV活性，且资源丰富，对环境友好，因此，开发高效、低毒、环保的抗病毒药物逐渐成为研究热点[3-5]。

薇甘菊(Mikania micranthaH.B.K.)属菊科假泽兰属(Mikania)植物，被列为世界上最具危害性的100种外来入侵物种之一。薇甘菊有很强的攀援能力，可影响植物的光合作用，并吸取植物生长所需养分，最终导致植物死亡，对入侵地的经济和生物多样性造成严重破坏[6]。已有文献报道薇甘菊含有丰富的化学成分，粗提物具有调节植物生长、抗菌、抗癌、抗炎、杀虫等作用[7-9]。但目前有关薇甘菊提取物抗烟草花叶病毒作用的研究未见报道。为此，本研究对薇甘菊提取物进行了抗TMV活性追踪，筛选具有抗TMV的有效成分，以期为薇甘菊综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物 薇甘菊地上部于2016年8月采自云南腾冲(98°05′～98°46′E、24°38′～25°52′N)，由西南林业大学胡世俊副教授鉴定。

1.1.2 供试病毒 TMV(U1)普通株系，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，繁殖于普通烟K326上，参照Gooding等[10]的方法进行提纯。

1.1.3 供试寄主 TMV枯斑寄主为心叶烟(Nicotiana glutinosa)、TMV系统侵染寄主为普通烟K326，本课题组自行培育，待烟苗长至4～6片真叶时进行活性测定。

1.2 试验方法

1.2.1 提取与分离 薇甘菊地上部(13.05 kg)干燥粉碎，甲醇回流提取3次，每次30 L，每次3 h，用旋转蒸发仪浓缩得到甲醇提取物。将所得提取物溶于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通过减压浓缩得到石油醚萃取物(234.55 g)、乙酸乙酯萃取物(120.15 g)、正丁醇萃取物(213.00g)。乙酸乙酯萃取物经硅胶(200～300目)柱色谱分离，用石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)体系为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检测，得到Fr1～Fr55个不同馏分。正丁醇萃取物经大孔树脂、乙醇-水(0∶95-95∶0)梯度洗脱，浓缩得到Fr1～Fr55个不同馏分。石油醚萃取物经硅胶(200～300目)柱色谱分离，用石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脱，浓缩得到Fr1～Fr55个不同馏分。

1.2.2 抗TMV活性测定 采用活体半叶枯斑法测定[4，11]。挑选健康长势一致的心叶烟，每株挑选叶龄和叶片大小相似的3片上部叶，用提取物处理叶片的一半，另一半用相同浓度的DMSO处理作为对照，以市售宁南霉素作为阳性对照。采用三种处理方式:(1)先施药:在接种病毒前6 h将提取物涂抹在叶片上；(2)后施药:在接种病毒后6 h将提取物涂抹在叶片上；(3)混合施药:将提取物与病毒充分混匀30 min后接种病毒。用金刚砂摩擦接种病毒，接种10 min后用蒸馏水将金刚砂洗净，将烟苗放在无虫温室中培养，3～4 d后待枯斑症状明显时，统计试验结果，并计算抑制率。

抑制率(%)＝(对照平均枯斑数-处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数×100。

1.2.3 抑制病毒增殖活性测定 采用离体半叶枯斑法[11]测定。挑选叶龄和叶片大小适中的3片中上部叶，全叶摩擦接种TMV 200μL，接种病毒后6 h将叶片剪下，沿中脉将叶片一分为二，左半叶浸入盛有1 mg/mL供试提取物的培养皿中作为处理，右半叶浸入盛有1 mg/mL DMSO溶液的培养皿中作为对照，以市售宁南霉素作为阳性对照。每个提取物3次重复，放在室内培养，48 h后统计试验结果，按上述公式计算抑制率。

1.2.4 抑制病毒活性测定 采用叶圆片法测定[3]。喷施DMSO溶液作为对照，喷施1 mg/mL提取物作为处理，以宁南霉素为阳性对照。施药24 h后接种TMV，48 h后打直径为1 cm的圆片，每片叶打取10个置于离心管中。用ELISA法[12]测定OD405值，以健康烟苗作为阴性对照。以处理OD405/阴性对照OD405值＞2.1作为阳性判断的标准[13]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计，运用SPSS 17.0统计软件(One-Way ANOVA，Duncan post hoc testP＜0.05)进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 提取物对TMV的抑制活性

由表1可知，先施药结果表明，甲醇提取物、正丁醇萃取物对TMV的抑制活性最强，抑制率分别为60.03%、58.61%，均显著高于宁南霉素；石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水层均低于宁南霉素。后施药结果表明，甲醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物对TMV侵染有较好的治疗作用，抑制率均显著高于宁南霉素；正丁醇萃取物和水层对TMV无治疗活性。混合施药结果表明，甲醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物对TMV有不同程度的钝化活性(图1)，其中甲醇提取物的钝化活性显著，抑制率为70.27%，显著高于宁南霉素；乙酸乙酯萃取物的抑制率为50.00%，与宁南霉素相当；石油醚萃取物低于宁南霉素；正丁醇萃取物和水层对TMV无体外钝化活性。

表1 不同提取物对TMV侵染的抑制率 (%)

图1 薇甘菊不同溶剂提取物对TMV的钝化作用

2.2 萃取物馏分对TMV的抑制活性

在萃取物的活性测定中，由于正丁醇萃取物仅表现出保护作用，故仅筛选正丁醇萃取物各馏分的保护作用。萃取物馏分抗TMV活性见图2，从保护活性的结果来看，正丁醇萃取物馏分Fr2对TMV侵染有较好的保护作用，抑制率为56.83%，高于宁南霉素(49.30%)，其他萃取物馏分的保护活性均低于宁南霉素。从治疗活性的结果来看，乙酸乙酯萃取物馏分Fr4和馏分Fr5对TMV的治疗活性显著，抑制率分别为52.75%、52.11%，均高于宁南霉素(47.77%)；石油醚萃取物馏分Fr3和乙酸乙酯萃取物馏分Fr3的治疗活性均相当于宁南霉素；石油醚萃取物馏分Fr1、Fr4、Fr5对TMV无治疗活性，其他萃取物馏分的治疗活性均低于宁南霉素。从钝化活性的结果来看，石油醚萃取物馏分Fr4和乙酸乙酯萃取物馏分Fr2～Fr4对TMV的钝化活性显著，抑制率分别为71.67%、63.27%、58.00%、58.52%，均显著高于宁南霉素；石油醚萃取物馏分Fr1、Fr2和Fr5无钝化作用，其他萃取物馏分的钝化活性均低于宁南霉素。

图2 萃取物馏分对TMV侵染的抑制作用

2.3 提取物对TMV增殖活性的影响

由表2可知，5种提取物均具有抑制TMV增殖的作用，其中甲醇提取物抑制活性较显著，抑制率高达53.14%，略低于宁南霉素；正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、水层4种提取物的抑制增殖活性均显著低于宁南霉素。由表3可知，石油醚萃取物中馏分Fr4对TMV增殖抑制活性最强，抑制率高达61.42%，显著高于宁南霉素；馏分Fr2次之；馏分Fr1、Fr3、Fr5对TMV增殖无抑制作用。乙酸乙酯萃取物中馏分Fr1～Fr5对TMV增殖有不同的抑制作用，抑制率在18.34%～48.95%之间，抑制率均低于宁南霉素。正丁醇萃取物中，馏分Fr1～Fr5对TMV增殖抑制活性较强，5个馏分间抑制活性差异不显著，且均低于宁南霉素。

表2 不同提取物对TMV增殖的抑制作用

表3 萃取物馏分对TMV增殖的抑制率 (%)

2.4 叶圆片间接ELISA检测结果

由图3可知，除水层外，其他4种提取物对TMV增殖均有较好的抑制作用，高于宁南霉素；由图4可知，石油醚萃取物馏分Fr1、乙酸乙酯萃取物馏分Fr5、正丁醇萃取物馏分Fr3和馏分Fr5对TMV增殖均有显著的抑制作用，高于宁南霉素。试验结果显示，处理OD405/阴性对照OD405值均小于2.1，即提取物及萃取物馏分的间接ELISA检测结果均表现为阴性，说明提取物及萃取物馏分均具有抑制TMV增殖的活性。

图3 提取物间接ELISA检测结果

图4 萃取物馏分间接ELISA检测结果

3 讨论与结论

植物源活性物质具有低毒、低成本、对环境友好等特点，近年来，有关植物源抗TMV活性物质的研究报道逐渐增加。郭文慧等[14]研究发现山苍子、平姜、苦参、八角、白屈菜、余甘子和五倍子植物提取物对烟草具有显著的诱抗活性。目前，从植物中分离得到的倍半萜内酯、柠檬苦素、苦木素等化合物均有较强的抗TMV活性。因此，从植物中分离纯化化合物、筛选具有抗病毒活性的化合物，已经被证明是一种对抗植物病毒的有效方法[15-17]。

已有研究报道，薇甘菊提取物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用[18，19]，但至今未见有关抗烟草花叶病毒的报道。本研究发现薇甘菊甲醇提取物对TMV的侵染有较强的保护、治疗和钝化作用，且活性均显著高于宁南霉素，表明薇甘菊中存在抑制烟草花叶病毒增殖的活性物质。对薇甘菊提取物进行活性追踪发现，从保护活性的结果来看，正丁醇萃取物馏分Fr2对TMV侵染有较好的保护作用，高于宁南霉素，其他萃取物馏分的活性均低于宁南霉素。从治疗活性的结果来看，乙酸乙酯萃取物馏分Fr4和馏分Fr5对TMV的治疗活性显著高于宁南霉素；石油醚萃取物馏分Fr3和乙酸乙酯萃取物馏分Fr3的治疗活性相当于宁南霉素；石油醚萃取物馏分Fr1、Fr4、Fr5无治疗作用，其他萃取物馏分的治疗活性均低于宁南霉素。从钝化活性的结果来看，石油醚萃取物馏分Fr4和乙酸乙酯萃取物馏分Fr2～Fr4的钝化活性均显著高于宁南霉素；石油醚萃取物馏分Fr1、Fr2、Fr5无钝化作用，其他萃取物馏分的钝化活性均低于宁南霉素。结果显示乙酸乙酯萃取物各馏分均表现出保护、治疗和钝化作用，表明抑制TMV增殖的活性成分主要集中在乙酸乙酯层，可能是因为中等极性成分更容易被烟草吸收和利用，而各馏分对TMV的抑制作用有显著差异，这可能与各馏分的化学成分和抗病毒物质不同有关。提取物均具有抑制TMV增殖的作用，其中甲醇提取物抑制活性较显著，高于宁南霉素；提取物及萃取物馏分能抑制TMV在烤烟K326中增殖。

植物中的抗病毒作用通常是多种成分综合作用的结果。梁红艳等[20]在从木瓜中分离抗TMV活性成分的过程中发现，随着抗TMV活性成分的逐步分离，组分的抗TMV活性呈下降趋势。沈建国等[21]在研究臭椿抗TMV活性的过程中发现，经硅胶柱层析分离得到的组分对TMV的抑制活性均低于原臭椿乙醇提取物。谭庆伟[22]对臭椿抗TMV活性的研究结果表明，臭椿抗TMV侵染和增殖的活性是由一类或几类物质的协同作用形成的。本研究发现薇甘菊甲醇提取物抗TMV活性显著，随着薇甘菊中抗TMV活性成分的逐步分离，组分对TMV的抗病毒活性呈下降趋势，分析其原因可能是由于分离过程中部分活性成分丢失或抗TMV活性是多种成分的协同作用。本研究以薇甘菊为研究对象，扩展了抗TMV活性物质的研究范围，进一步丰富了薇甘菊的生物活性谱，下一步将对活性好的组分中具体起作用的化学成分进行分析，为进一步开发植物源生物农药提供理论基础和科学依据。