水稻基因遗传转化方法研究进展

郭 涛，沈任佳，王加峰

(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心,广东 广州 510642)

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上超过一半人口以水稻为主食。据联合国粮农组织统计，全球水稻年产量超过7亿t，我国是最大的水稻生产国，产量均占全世界产量的30%[1-2]。提高水稻产量、改善水稻品质，对保障我国乃至世界的粮食安全、提升人民饮食品质十分重要。

水稻产量的提升和品质的改进，可通过遗传转化技术实现。水稻遗传转化是指通过生物体(多为病原菌)或具有生物相容性材料的介导，将外源DNA、RNA、蛋白质或其复合体等生物大分子导入水稻体内，进行基因功能研究或者改良水稻生物性状的一项技术。作为一种重要的单子叶模式植物，水稻基因组大小仅为420～466 Mb，由约4亿个碱基对构成，正常情况下栽培稻为二倍体，适宜进行遗传转化研究[3-4]。水稻遗传转化技术在基因功能验证、信号通路转导研究、农艺性状改良及优良种质选育、生物产品的生产上均发挥着十分重要的作用[5-7]。

本文将从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，对水稻遗传转化的研究进展进行综述，重点介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展，最后结合2类介导转化方法的特点和在建立转化体系中发展起来的DNA-free技术，对水稻遗传转化方法进行展望。

1 生物介导转化法

1.1 农杆菌介导转化法

农杆菌Agrobacterium是目前水稻介导遗传转化最常用的生物，主要包括根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens和发根农杆菌A.rhizogenes。自然条件下，农杆菌具有将自身基因转入植物体内的能力：植物受伤后分泌的酚类物质，吸引农杆菌趋化性感染伤口并进入植物体内，之后农杆菌裂解释放Ti质粒，质粒中T-DNA插入植物细胞基因组并表达，合成破坏植物细胞分裂调控系统的冠瘿碱类物质，诱发细胞癌变分裂进而形成冠瘿碱瘤。由于Ti质粒毒性区有负责转移T-DNA的基因，即使毒性区与T-DNA处于不同DNA片段，仍可协助T-DNA转移，因此科学家通过设计包含选择标记基因、待转化基因的T-DNA区，形成小载体，与Ti质粒形成共转化的双元质粒系统，用于将外源基因引入水稻体内[8]。

农杆菌介导转化体系具有外源基因转移效率高、拷贝量低、沉默率低、便于通过标记基因检测以及可转化长片段T-DNA( ＞ 150 kb)的优点，广泛应用于植物遗传转化，并在植物生理分子机理验证、作物农艺性状改良、生产生物产品等方面发挥巨大作用[9]。然而，由于单子叶植物的细胞壁伸展蛋白和分生细胞的结构特点，其不容易受农杆菌侵染，导致农杆菌转化体系的建立十分困难[10-11]。作为典型的单子叶植物，水稻在早期研究中通过农杆菌转化再生较为困难，如转化粳稻成熟胚仅能获得插入外源基因的愈伤组织，而未获得再生植株[12]。

为建立高效稳定的水稻农杆菌介导转化体系，研究者以种胚、稻穗、茎尖和愈伤组织等器官组织为转化材料，建立了适宜不同类型、品种水稻转化的试验体系。

1.1.1 种胚转化 在早期研究中，水稻的种胚，包括成熟胚、未熟胚和盾片，是转化率较高的材料[8]。作为转化材料，种胚具有易获取、无需诱导、再生时间短的优点，但目前在籼稻的遗传转化上需进一步提高转化效率。

1990年，水稻首次实现农杆菌介导的种胚转化，打破了只能通过原生质体转化的材料限制。通过原位杂交、GUS活性检测技术，Raineri等[12]确认获得有GUS活性的成熟胚分生愈伤组织，但因接种后粳稻‘富士光’和‘日本晴’的胚褐化硬化，或者只分化根不分化茎，因而未能获得再生植株。考虑到未熟胚再生能力强，粳稻‘Tainung62’的未熟胚被用于转化，同时通过改进共培养基、用不同启动子调控不同基因过表达，Chan等[13]获得了基因在各部位均过表达的R0代转化再生单株，并且R1和R2代在维持外源基因过表达的同时保持正常生长和结实，这表明种胚转化法具有获得稳定遗传株系的潜力，但存在转化效率低的问题，不适宜大规模应用。随后，研究者通过开发“超级双元”载体系统提高转化效率：EHA101菌株(piG121Hm质粒)体系成功转化顽拗型粳稻‘Tsukinohikari’，未熟胚筛选3周后的转化效率可达6%[14]；LBA4404菌株(pTOK233质粒)体系更是成功转化籼稻的未熟胚(品种为‘IR72’和‘TCS10’)，转化效率达1%～5%[15]。

为进一步提高转化再生效率，可使用再生能力强的盾片组织。农杆菌对水稻种子的早期感染能够增强后期愈伤组织的选择效率，Toki等[16]通过预培养成熟种子1 d后再取盾片进行转化，在1个月内便成功获得再生转基因植株，既缩短了离体组培的周期、减少了细胞在脱分化状态长期组培的体细胞变异，又可避免直接转化盾片导致的效率低下问题。

1.1.2 稻穗转化 1998年，农杆菌浸花法首次在拟南芥中实现外源基因转化[17]。操作简便的浸花法使得拟南芥成为应用最广泛的遗传转化模式植物。水稻作为自交结实的结穗作物，和拟南芥有相似的结构特征，能否通过浸花法实现高效遗传转化，引起了研究者的关注。

为避免漫长的组培再生过程，研究者将泰国水稻‘RD41’小穗去顶后，在转化gusA的农杆菌AGL1悬浮液中浸泡1 min，25 ℃条件下套袋3 d后进行GUS分析和镜检。各花器平均转化率为12.73%，子房仅7.23%，花药最高，可达89.16%，且大部分阳性花药中的花粉有GUS活性。这与拟南芥中雄性生殖系(花粉)转化率低、雌性生殖系(子房)转化率高的现象相反，表明水稻中花药、花粉有更大的转化潜力，同时直接浸穗即可转化花粉[18]。随后，该团队深入检测转化效率，并尝试滴花法：将转化gusA的农杆菌菌株AGL1和EHA105在悬浮培养液中培养至D600nm为0.8～1.0后，在标准接种培养基重悬浮培养获得活化菌液，将穗浸入菌液1 min(浸花法)或将菌液置于去顶小穗中(滴花法)，共培养2 d。浸花法中EHA105菌株转化效果较好，结合PCR检测和GUS分析，gusA阳性率为1.05%(3/286)，与其他作物1.5%～3.0%的水平接近；滴花法瞬时转化效率高，但花在2 d内褐化死亡，说明该法不适用于水稻转化[19]。

有研究以黑米为材料，比较以愈伤组织为材料的离体转化法和以稻穗为材料的活体转化法，发现离体转化法的转化效率为活体转化法的5倍(1.51% / 0.31%)，但活体转化法因不需要经历组培阶段，用时30 d即可鉴定阳性株系。通过离体转化法，该研究获得了T1代表型正常、早花3周的转基因黑米[20]。

水稻浸花转化法操作简便、成本低，同时，由于不需要经历组培阶段，也避免了组培中材料污染从而影响植株正常生长的风险。但其转化效率低，没有特定的转化靶标位点，同时需要在花期用稻穗进行转化，有一定的时间限制，因此目前在水稻上尚未大规模应用[19-20]。

1.1.3 愈伤组织转化 愈伤组织处于代谢旺盛的脱分化状态，易于诱导产生胚状体，是进行遗传转化和植株再生较为理想的材料[21]。盾片是水稻种胚的组成部分，保护胚芽并为其提供养分。盾片胚性愈伤组织能再生出茎原基和根原基，具有离体再生频率高、周期短、再生植株育性好的优点，是水稻中常用于转化的愈伤组织类型[22-23]；但与种胚转化法相比，需要切取盾片并经历愈伤组织诱导及再生过程，人工和时间成本有所增加。

早期研究中，粳稻盾片胚性愈伤转化阳性率可达23%，而直接转化盾片的仅为9%，同时盾片胚性愈伤组织共培养即时转化效率达93%，远超根源愈伤组织的21%[14]。顽拗型籼稻‘Basmati’的盾片胚性愈伤转化效率也高达22%，接近粳稻和双子叶植物，并且R1代形态和育性正常[24]。在确认盾片胚性愈伤组织的转化能力后，研究者通过改进愈伤组织再生体系，如探索诱导转化物的浓度、愈伤组织诱导生长时长、培养基碳源种类和激素用量等，提高转化再生率，籼稻‘IR64’转化后的筛选再生率可达6.94%[25-26]。

1.1.4 茎尖转化 茎尖是植物中较早用于快速无性繁殖的部位[27]。茎尖来自已分化的器官，与愈伤诱导系相比，变异更少，符合遗传转化的要求[28]；同时有较强的分生能力，借助组培体系能快速扩繁，快捷省时[29-30]。

茎尖转化法首先在矮牵牛Petunia和玉米Zea mays上得以实现，通过茎尖与农杆菌的共培养，成功获得阳性转化体[30-31]。1994年，Hiei等[14]对粳稻‘Tsukinohikari’进行2次转化，共培养即时转化率高达90%，但经筛选培养后未能成功。随后，通过在茎尖分生组织区制造伤口后进行共培养，bar基因成功转化至粳稻‘Maybelle’中，转化株系的抗除草剂表型一直遗传至R2代，但R2代的分离不遵守孟德尔定律[32]。

籼稻茎尖转化体系发展较慢，该体系首先在少数籼稻品种中建立，稳定转化效率为5.6%～8.0%[33]。通过调节添加的激素及浓度，该体系适用性大大拓宽，能够实现‘IR64’等8种籼稻的高效再生，GUS基因转化率(共培养3 d后)高达80%～100%[34]。

1.2 农杆菌以外的生物介导转化法

由于农杆菌介导转化法在籼稻中转化率不高、在非科研应用领域存在专利限制，科学家开始关注农杆菌以外的生物介导转化法。研究发现，根瘤菌Sinorhizobium、Rhizobium和附着剑菌Ensifer adhaerens可通过转入合适的双元载体后侵染转化植物[35-36]。

1.2.1 根瘤菌 由于亲缘关系较近，具有诱导植物冠瘿潜力的苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti首先被用于转化水稻[37]。该菌导入去毒Ti质粒pTiWB3和双元载体pCAMBIA1405.1后，转化水稻种子胚性愈伤组织，GUS活性率为0.6%(4/687)且仅获得单个再生成苗的株系；对照的农杆菌转化试验，50%～80%的愈伤组织检测到GUS活性，20%愈伤组织再生成株[38]。Rahmawati等[39]也发现S.meliloti转化效率为0～1%，但根瘤菌Rhizobium leguminosarum转化粳稻和籼稻，GUS瞬时表达率均比农杆菌高。这些研究表明，适宜水稻转化的菌种具有特异性，可能有其他转化效率更高的菌种。

1.2.2 附着剑菌 附着剑菌E.adhaerens(OV14)在分类上更接近根瘤菌属Rhizobium，生物安全性更高[40]。在筛选病菌替代农杆菌介导转化植物的研究中，附着剑菌对土豆的转化率高达35.1%，具有转化经济作物的潜力，有利于打破农杆菌介导技术应用的专利限制[41]。比较OV14和农杆菌EHA105对粳稻gus基因的转化效率发现，OV14转化‘Nipponbare’的阳性率(7.2%)高于EHA105(4%)，而EHA105转化‘Curinga’的阳性率(32%)高于OV14(16%)，显示出2种菌株转化粳稻的品种特异性；OV14能实现顽拗籼稻‘IR64’的转化，侵染率高达90%，但阳性率仅约1%。外源基因通过OV14插入水稻基因组的模式与农杆菌类似，为随机插入，同时均可插入外显子[42]，但具体机理仍有待进一步研究。

2 非生物介导转化法

2.1 物理方法

物理方法是指通过轰击、电击和注射等物理手段将外源基因转化至水稻体内的转化方法，具有非基因型依赖、转化直接的优点，但在转化过程中容易出现因外力或电击作用导致的DNA片段破裂和非目的基因片段的插入，从而影响转化效果。报道较多的物理转化法主要有基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法。

2.1.1 基因枪法 基因枪法利用压缩空气，将粘有外源基因DNA的金粉颗粒打入细胞进行遗传转化。不需要经历“病原菌-植物体”互作的识别过程，基因枪法能够有效解决水稻农杆菌介导转化存在的基因型依赖、操作繁琐等问题，并且一次可转化大量细胞[43]。然而，基因枪法对细胞造成损害较大，不利于后期的分化再生，而且整合过程中易发生重排，不利于基因稳定遗传[44-46]。

基因枪法可转化的材料包括种胚、愈伤组织和叶绿体，转化首先在种胚上实现。为提高水稻除草剂抗性，在通过gus基因转化确认基因枪法转化水稻的可行性后，除草剂抗性基因bar成功导入美国重要商业品种‘Glufmont’和籼稻‘IR54’等多个品种的未熟胚，R1代性状分离符合孟德尔分离定律[47]。进一步的田间试验发现，对具有抗除草剂性状‘Gulfmont’和‘IR54’转化系叶施草铵膦，植株的正常生长未受影响，但四叶期野生型对照植株在施药7 d内死亡，表明基因枪法转化得到的水稻植株具有商用潜力[48]。

获取种胚需要耗费大量劳力，研究者尝试用愈伤组织进行高效转化再生，3～4周龄愈伤组织在转化后6～8周即可获得再生株系[49]。种胚诱导再生的愈伤组织具有较强分化能力，籼稻‘TN1’上建立的体系gus基因转化后植株再生率为2%～4%，粳稻‘Taipei309’胚性愈伤组织的悬浮细胞通过转化bar基因也获得草丁膦抗性[50-51]。后续研究通过改进‘Taipei309’的胚原愈伤组培体系，可实现携带2种基因的不同质粒的共转，并可通过Cre-lox介导的位点特异整合重组酶系统精准插入npt和gus基因，大大提升转化效率和精准性[51-52]。

叶绿体作为水稻中负责光合作用的细胞器，在外源基因遗传转化上有独特的优势。叶绿体基因遗传模式为母系遗传，转入叶绿体的基因不会通过花粉扩散到其他植物中，转化安全性高；同时转化基因表达量高、转化效果好[29,53]。虽然存在高效选择标记基因较少、转化后翻译产物难以检测和转化后代遗传不稳定等缺点，但仍应用于提高品种抗性、生产生物产品方面[29,54-55]。叶绿体转化法在水稻中的转化对象多为叶绿体发育前体-前质体，目前已成功实现转化和植株再生，但总体转化效率仍有待提高。该法首先实现荧光蛋白sGFP基因的转化并获得形态和育性正常的植株[55]；为提高转化效率，水稻叶绿体双顺反子位点特异性整合表达载体的元件被引入专门设计的载体pCTE04上，eGFP基因通过该载体转入盐生杜氏藻，可直接观测到强烈荧光，表明该转化体系的可行性[53]；基因枪法将具有TALEN编辑功能的pCE4-IALR和pCTE04载体共转水稻愈伤组织，转化效率为0.35%，是单独转化pCTE04的2倍[56]。

2.1.2 电击法 高压电脉冲击穿细胞膜形成瞬间通道，进而促进外源DNA摄取的电击法，具有简便易行、适用物种广泛、可转化材料类型较多和转化效率高等优点[57]，但直接暴露在电解液中的待转化DNA在电击过程中易受损，影响转化效率[58]。

首次电击转化在水稻原生质体进行，成功获得转化抗生素类标记基因-氯霉素乙酰转移酶基因，同时该研究发现避免电极直接接触水稻原生质体的间接转化法操作快捷、污染较少且能保持原生质体活性[59]。后续试验改进原生质体再生体系，成功转化氨基糖苷磷酸转移酶基因至原生质体并获得再生植株[60]。转化原生质体存在材料易损伤，经历愈伤再生阶段时易发生多余的基因修饰等问题[43,61]。De Pádua等[62]使用籼稻茎尖进行转化，不仅成功建立阳性率高达13.8%的转化体系，且可遗传至R2代。考虑到未熟胚再生活性较强，Ren等[63]改进电击体系，用10 d龄未熟胚在0 ℃进行电击转化，胚存活率超过95%，并成功转化金属硫蛋白基因OsMT2bL和gus基因。

2.1.3 花粉管通道法 向授粉子房注射含外源基因的溶液，进而形成花粉管转化受精卵的花粉管通道法，由我国科学家提出[64]；同时期花色变异矮牵牛的创制，直接证明了该法的可行性[65]。该法转化水稻，具有不依赖组培、操作快捷省时的优点，而且相比传统育种方法，仅需3～4个世代即可固定性状，但也存在高世代分离比例大、外源DNA易丢失以及重复性差等缺点[29,66]。

我国较早利用花粉管通道法进行水稻遗传改良，1985年获得具有紫色颖壳性状的水稻，在各株系中占比72.7%，显示出花粉管通道法在水稻育种上的应用潜力[67]。Luo等[68]从分子水平上验证了该法的可行性，转化报告基因nptII的水稻小花结实率达20%，总体转化效率达4%，高于显微注射法。

花粉管通道法在水稻育种上应用近40年，目前在多个性状上已培育出表现突出的品系或品种。在早熟稻方面，转化多种植物混合DNA的‘垦D01-1381’在2002年黑龙江省第二积温带早熟组预备试验中较对照增产12.05%，排名第2，并作为亲本培育出适合黑龙江垦区旱育稀植的‘垦稻26’(垦02-55×垦94-1043/垦D01-1381，2014年审定)[69]；在晚熟稻方面，稗子DNA导入‘湘晚籼5号’获得的晚籼品系‘HK7’，在优质稻品比试验(晚籼常规稻组)中平均产量为6 787.5 kg/hm2，组内排名第1，食口性好[70]；在抗性方面，培育出抗除草剂品系‘E32’和抗稻瘟病品系‘HK119’，其中‘HK119’产量优异，且保持原受体优良米质[70-71]。

2.1.4 显微注射法 利用玻璃微量注射器，将外源基因DNA直接注入单细胞或组织的显微注射法，通常转化子房、原生质体和种胚等再生能力强的材料。该法可将核酸、蛋白质和人造物等多种物质同时注入同一细胞，实现多种介质的高效转化；然而，由于转化在细胞层面进行，对操作设备、技术要求高，转化前后相关工作繁琐[72]。

未授粉子房形成的愈伤组织可发育为单倍体植株，罗忠训等[73-74]通过显微注射法将玉米醇溶蛋白基因注入水稻‘景洪2号’未受精子房并诱导获得单倍体植株，虽然子房形成的愈伤组织阳性转化率达20%，但子房形成再生植株几率仅为0.2%。相比于子房，原生质体转化成功率高，人工和机器转化eGFP基因成功率均达7%～8%，但机器自动化操作效率比人工快17倍，显示出该方法自动化应用、高效转化的潜力[72]；此外，卵细胞和受精卵转化GFP基因也获得成功，转化后生存率较高[75]。由于只依靠物理操作进行转化效率较低，Baskaran等[76]往水稻种胚茎尖分生组织区注射携带gus基因的农杆菌液，转化效率高达40%，表明将生物和物理介导转化法结合有助于提高转化效率。

水稻方面显微注射转化法研究较少，且多集中于体系的建立，聚焦于转化材料、高效转化操作的探索，功能基因的转化及相关性状的遗传改良方面成果有限，这可能与该方法技术难度大有关。

2.2 介质材料介导

为减少物理方法转化法在转化过程中对DNA片段造成的损伤，科学家利用纳米材料、聚乙二醇(PEG)、脂质体和藻酸钙微珠等材料介导转化外源DNA片段。其中，纳米材料因具有多样的物理特性和较好的生物相容性，逐渐在水稻遗传转化中受到青睐。

2.2.1 纳米材料 纳米材料是指颗粒尺寸为1～100 nm的材料，因其尺寸微小而具有不同于传统宏观材料的力学、电学和磁学特性。纳米材料载体可以通过包裹、静电作用、化学偶联等方式吸附和压缩 DNA，形成纳米载体基因复合物，透过细胞壁转化至细胞中。

非金属材料方面，碳化硅晶须(Silicon carbide whisker，SCW)是最早应用于水稻转化的纳米材料，其颗粒硬度大、边缘锋利，在与细胞搅拌过程中可穿透细胞，进而转化混合液中的外源基因片段[77]。通过混合水稻细胞、SCW和携带gus基因质粒，gus基因成功得到转化，每克细胞中有533个发光细胞[78]；而与超声处理结合，可进一步提高细胞悬浮液的转化效率[79]。虽然碳化硅晶须介导法具备操作便捷、成本低、待转化DNA纯度要求低的优点，但SCW作为一种致癌物，安全性不容忽视，因此研究者尝试用硼酸铝替代SCW，最终成功转化种胚胚性愈伤组织[29,78,80]。碳量子点(Carbon dots，CDs)是另一种在水稻遗传转化上有应用潜力的非金属纳米材料，由尺寸小于10 nm的碳纳米颗粒组成，具有毒性低、水溶性良好及生物相容性等优点[81]。研究发现，CDs表面引入聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)形成的带正电的纳米复合物CDP，吸附DNA的同时保护其免受DNA酶降解，进而实现水稻高效遗传转化和蛋白质表达，目前已成功转化β-葡萄糖醛酸酶基因至成熟胚诱导的愈伤组织中[82]。

金属纳米颗粒在转化过程中对外源基因DNA起保护作用。传统金颗粒尺寸可达4 μm，DNA被包裹在颗粒外围，轰击时易造成DNA损伤；而尺寸不足1 μm的金纳米颗粒则吸附在DNA外围，轰击时能保护DNA。将金纳米颗粒与分别携带毒蛋白基因cryIA(c)、标记基因hph的2种质粒混合，共转水稻愈伤组织，再生植株中分离得到无标记基因成分的可育阳性植株，证明金纳米颗粒与基因枪法、质粒共转相结合获得DNA-free转基因水稻的可行性[83]。类似地，磁性纳米粒子(Magnetic nanoparticles，MNPs)在电击法转化GFP基因的过程中包裹并保护DNA，与传统电击法相比转化效果大大提升，克服了电击法损伤DNA的缺点[58]；MNPs对DNA的保护作用在另一种基因编辑载体pRGEB32上也得到了证明，并成功介导了香味基因fgr在‘日本晴’中的基因编辑[84-85]。

2.2.2 其他介质 聚乙二醇(PEG)、脂质体和藻酸钙微珠因具有生物亲和性，也可作为介质介导水稻的遗传转化。由于总体转化效率不高、转化材料一般为制备繁琐的原生质体，这些材料目前应用较少，更多的是作为补充途径。

PEG介导转化法是水稻最早的遗传转化方法。PEG与多种有机物组分有良好的相溶性，可引起细胞膜表面电荷紊乱，干扰细胞膜识别功能，进而促进细胞吸收外源DNA；然而该法需要转化原生质体，存在去壁流程繁琐、再生缓慢和转化效率低的缺点[78]。PEG介导的水稻原生质体转化再生体系，基于原生质体的体细胞胚胎发生建立，与PEG浓度和原生质体密度密切相关[86-87]。基于该体系，水稻原生质体成功转化氨基糖苷磷酸转移酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因和gus基因，并再生得到阳性植株，转化率达2%～3%[88-90]。

脂质体介导转化法也较早应用于水稻转化。脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的双分子膜结构体，将外源DNA包裹其中形成的复合体，可通过细胞膜融合和内吞作用转化至细胞中，若结合转化原理类似的PEG共同转化原生质体，可进一步提高转化效率[91]。脂质体首次介导转化水稻原生质体的研究中，原生质体再生的愈伤组织转化率达14%[92]；基于该体系，人体免疫反应重要糖蛋白α-干扰素基因成功转入水稻原生质体并获得转基因植株，转化率为10.4%，显示出脂质体介导创制功能型水稻的潜力[93]。

作为一种亲水类多聚糖，藻酸钙在Ca2+存在条件下，凝固成可吸附大片段DNA的生物活性微珠，具有较高的生物安全性。藻酸钙微珠可转化各种长度的DNA片段，小可转化4.1 kb的pUC18-sGFP至水稻原生质体，大可转化124 kb的酵母人工染色体(YAC)至酵母中，具有广泛的转化适用性[94-95]。然而，传统人工操作转化GFP基因至水稻原生质体成功率极低( ＜ 0.1%)，为此，Wada等[96]从改进藻酸钙微珠形态入手，利用声波发生器和微型注射器泵组成的简单装置生产尺寸更小、更均匀的微珠，以提高转化效率。

3 总结与展望

3.1 优化转化材料和改造农杆菌提高水稻遗传转化效果

生物介导转化法中，农杆菌介导转化法因转化效率高、体系成熟稳定应用较广。目前农杆菌介导转化的材料主要有种胚、稻穗、茎尖和愈伤组织(多从种胚诱导得到)。种胚及其愈伤组织转化体系较为成熟，但再生体系具有高度的基因型依赖性，需经历漫长的愈伤再生周期(2～3个月)，并且需要探索适应不同品种水稻的培养基组分、培养环境和时间，品种间转化效果差异较大[9]；稻穗和茎尖转化法则由于再生无需经历愈伤阶段、转化周期较短(约1个月)，同时转化体系的建立不依赖品种基因型，在品种繁多、品种间差异较大的水稻转化方面具有更广阔的应用前景[20,97]。稻穗和茎尖转化法分别转化的是生殖器官和营养器官，2种方法可以取长补短、互补使用。稻穗转化法具有操作便捷的优点，但本质上为稻穗的活体转化，只能在水稻生殖生长期进行，时间较为受限，以广州一年2季的种植模式为例，早造需在5—6月转化，晚造需在9—10月转化；茎尖转化法的材料主要来源于种子诱导4 d后得到的茎尖分生组织，由于种子可低成本长期贮存、茎尖可快速诱导，因此茎尖转化可随时进行，但后代植株仍存在体细胞嵌合问题，获得稳定遗传的转化株系周期较长[29,32]。因此，水稻生殖生长期可进行稻穗转化，目前多在抽穗期伊始取穗转化[18-20]，同时也可考虑在抽穗前1～2 d的花粉完成期(三核花粉期)进行转化以加快进度，此时花粉发育全部完成，符合转化要求[98]；而在营养生长期，则可诱导种子长出茎尖分生组织进行转化。

除了合适的转化材料，改造介导转化的菌种也是提高转化效果的另一个方面。单子叶植物细胞壁的结构特点，加上农杆菌的T4SS分泌系统触发了植物PTI (PAMP-triggered immunity)反应，导致农杆菌难以高效地转化单子叶植物[11,99]；而革兰阴性细菌针状结构的T3SS分泌系统，有助于阻断植物PTI反应，使细菌在宿主内生长繁殖，这在水稻、小麦和大麦等单子叶植物中均有报道[100-101]。科学家利用T3SS分泌系统对农杆菌进行改造，使农杆菌抑制植物PTI反应的同时正常整合外源基因，单子叶植物柳枝稷转化效率提高近4倍[102]。因此，后续研究可以整合T3SS分泌系统和包含水稻特异性Ti质粒的农杆菌，提高转化效率。

3.2 纳米材料介导转化法有望成为水稻非生物介导转化发展的方向

非生物介导转化法主要有物理方法和介质材料介导转化法。由于不涉及“病原体-植物”识别过程，非生物介导转化法不存在基因依赖性，可转化的水稻品种广泛；但物理方法转化容易造成细胞和外源DNA的损伤，而以PEG、脂质体和藻酸钙微珠为代表的传统介质材料，则需要转化获取困难的原生质体。作为一种新兴材料，纳米材料在水稻转化的研究中越来越体现出生物相容性、友好性和广适性。从早期通过SCW刺伤细胞促进其吸收溶液中的外源DNA，到金纳米颗粒包裹外源DNA轰击愈伤组织，到现在通过MNPs携带并保护外源DNA、在磁场下转化花粉，纳米材料介导转化的过程中越来越重视对外源DNA和转化细胞的保护，这有利于提升转化再生效果、减少非目的基因片段的插入[77,83-84]。

随着CRISPR-Cas9技术的发展，纳米材料介导转化CRISPR载体有望成为未来水稻遗传转化的发展方向。由于CRISPR/Cas9技术仅编辑水稻自身基因、不引入其他物种基因，可实现无外源DNA片段残留的基因编辑[103]，CRISPR体系在水稻遗传转化应用的安全性较高；同时，纳米材料能高效负载和保护CRISPR载体，形成压缩复合体，有利于细胞通过吞噬作用吸收外源DNA[85,104]，因此，利用纳米材料携带CRISPR载体在转化水稻上具有一定应用潜力，目前已实现MNPs介导香味基因fgr在‘日本晴’中的编辑[84]。若能结合花粉培养技术，转化水稻小孢子诱导的愈伤组织再生得到单倍体植株，并进行染色体加倍，则可快速得到纯合二倍体植株，该技术已在大麦上应用[105]。

3.3 应用DNA-free和单倍体诱导技术实现水稻安全高效的转化和育种

DNA-free技术是一种不引入目的基因以外DNA片段或完全不引入外源基因的遗传转化技术，由于在转化过程中不引入来自农杆菌的外源DNA，转化作物在商业化应用中受到的监管及限制较少[106]，可大大拓宽其商业化应用前景。早期水稻通过共转分别携带目的基因、标记基因2种载体，在发生分离的后代中选择仅含有目的基因的株系实现DNA-free[107-108]。后续研究通过电转CRISPR质粒或Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNPs)至合子中，实现无外源DNA残留的基因编辑[103]，应用无需供体DNA插入的基因组编辑技术甚至可实现911 kb的大片段插入，以创制抗除草剂株系[109]。

然而，对每个基因分别进行编辑和纯合株系筛选仍费时费工，若能应用单倍体诱导技术实现规模化编辑，则可大大提高育种效率。目前，水稻建立了基于BBM4卵细胞异位表达和MiMe突变的高结实率无融合生殖体系，母本可通过孤雌生殖产生双单倍体(Double haplord，DH)种子[110-111]。水稻为雌雄蕊同花的自花授粉作物，通过浸穗转化可同时转化雄蕊和雌蕊[18]，因此可参考玉米将具有编辑特定基因功能的单倍体诱导系(Haploid induction，HI)父本与优良母本杂交、获得特定基因编辑的纯合后代株系的方法[112]，通过稻穗转化法，快速引入CRISPR系统至水稻HI的花蕊中编辑特定基因，再通过无融合生殖获得纯合DH后代，实现水稻高效、规模化的分子育种。