影响绒山羊胚胎移植效果的因素分析

薛 冰

（ 辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 辽阳 111000 ）

绒山羊胚胎移植技术也称受精卵移植，是对遗传性能和生产性能优良的母羊进行超数排卵、人工授精，将早期的胚胎从供体母羊体内取出，移植到生理状态相同的受体母羊子宫内，使之继续发育成优良后代的技术[1]。绒山羊胚胎移植技术可充分发挥优良母羊的繁殖潜力，提高繁殖效率、缩短世代间隔、提高生产效率，对绒山羊的生产实践具有十分重要的意义[2]。但在胚胎移植的过程中存在多种内在或外在的因素会对胚胎移植的效果产生影响，进而影响最终的移植效率。本文拟从激素和相关材料选择、超数排卵、人工授精、技术水平、受体羊发情状况、供受体羊移植后饲养管理及胚胎质量、不同季节等方面分析影响绒山羊胚胎移植的因素，为获得满意的胚胎移植效果及相关工作开展提供参考。

1 材料因素

1.1 激素

进行超数排卵处理时，供体母羊的年龄、子宫内环境、胎次、体重、营养水平等因素均会对激素的使用剂量产生影响[3]。激素的种类、贮存、注射方法和部位等因素也会对超排效果产生影响，经产绒山羊和初产绒山羊使用的激素剂量也应不同。确定激素剂量时，体重和体况等也是应充分考虑的因素。此外，不同生产厂家、时间、批次的药品性能也存在一定的差异，必要时在使用前需经过药品试验[4]。

1.2 试剂

胚胎移植过程中培养液的制备至关重要。培养液的主要成分是水（应使用无菌的超纯水）和血清，超纯水使用超纯水仪制备，仪器型号pulsel+pURELABFlex，超纯水电阻率一般应大于10 MΩ，优质超纯水应达18.25 MΩ。血清的组成比较复杂，使用前要对购买的血清进行检测，验证是否符合处理要求[5]。培养液还需检测pH值、渗透压和毒性。其他的试剂和药品要严格分区贮存和放置，配置溶液时要保持无菌，精确称量，贴好标签并做好储藏。

1.3 设备与耗材

使用仪器一般包括：体式显微镜、羊专用腹腔镜、水浴锅、加热板、集卵杯、35 mm培养皿、二路式冲胚管、巴氏玻璃管、套管针、0.22 μm 滤器、微量移液枪（1 mL 和200 μL）、枪头（1 mL 和200 μL）、酒精灯、75%酒精、95%酒精、面巾纸、方瓷盘、记号笔、记录本等[6]。设备和耗材使用时要注意无菌操作[7]，实验室保持整洁、干净、无菌，制备溶液时要做好玻璃容器的清洁和无菌处理。

2 处理因素

2.1 超数排卵

超数排卵是绒山羊胚胎移植首要的基本措施，适宜的季节为9 月下旬至11 月上旬[8]，供体母羊在超数排卵前需要观察1~2个完整的发情周期，并做好记录。超排药物使用进口促卵泡激素（FSH），以加拿大产的FOLLTROPIN—V（20 mL/瓶）为首选，一般使用剂量为8 mL，效果比较稳定。目前，同期发情处理主要使用阴道内放置孕酮栓（CIDR）法，以新西兰产的效果最好[9]，操作方法简单，是目前主要的同期发情处理方法。供受体同一天放栓，之后每天到羊舍观察是否有栓脱落并及时补放。对供、受体羊进行处理时，应注意以下两方面的问题：

（1）目前使用低剂量超排要保证冲胚数量多、质量好、妊娠率高[10]。超排前应仔细阅读药品说明书，稀释FSH时，使用一次性无菌注射器精确量出20 mL 稀释液，稀释时针尖对准瓶壁，不要冲出泡沫或洒出液体。稀释后的药品必须保存在4 ℃的冰箱内，最好是现用现配。进行超排注射时，注射位置选在臀部三角肌部位，早上打左边，晚上打右边。超排打针最忌打飞针，必须深部肌肉注射；打针时必须有记录，以免重复注射。对超排时的天气及温度变化也要记录详尽，积累相关资料。

（2）选择谱系清楚、检疫合格、遗传性能稳定、生产性能优良、精液品质良好的公羊，采取本交和人工授精。本交是经试情的母羊发情后与种公羊混圈，观察到首次配种后同圈超过24 h、配种比例在1∶2 之内以保证有效配种。种公羊数量不足或依照选配计划通常采用人工授精方式。

2.2 人工授精

种公羊精液的品质是提高绒山羊胚胎移植成功率的前提，可保障提供足量的合格胚胎。公羊应具有较高的育种价值和优良的遗传特性，检查未患有布氏杆菌病、结核、副结核等疾病，生殖系统功能正常，身体状况良好，精液品质好，膘情适中。成年产绒量应达1 500 g以上，经后裔测定具有稳定的遗传特性，精液品质良好，活力达0.7以上。

精液品质的优劣是提高绒山羊受胎率的关键。常温人工授精实际操作中要求精子活力在0.7 以上，每次输精有效精子数不少于30×106。精液检查必须在37 ℃的环境中进行，否则精子运动迟缓，影响检查结果。精液采集后，越快稀释越好，否则精子会因缺乏营养而死亡，稀释后的精液要保持在25~30 ℃的环境中。采精前对公羊外生殖器、采精、稀释、输精用器皿严格消毒，配种时对母羊外阴部要严格消毒，一只羊用一个开膣器，避免重复使用。输精次数不少于3次，绒山羊最好隔6 h输精一次，超排后的供体第二次配种最重要。授精前要检查精液的品质，对精子的活力进行鉴定，以保证较高的受精率。影响受精的因素有很多，包括输精时间、部位、次数、精液质量及活力等。为保证输精的成功率应在上、下午各输精1次，间隔8~12 h为宜，第2 d若母羊继续发情应再输精1次直至停止发情。

2.3 技术水平

供体的采胚均采用手术法，分为2~4细胞期和桑囊期；受体母羊进行胚胎移植现主要采用手术法和非手术法两种方式[11]。手术法是在腹部作一切口，找到输卵管和子宫角引出切口外，用注射器将冲洗液注入输卵管或子宫，另一方向用试管或表皿接取冲洗液。但会使子宫、输卵管和卵巢暴露于体外，易发生出血或粘连现象[12]，这也是影响胚胎移植成功率的一个制约因素[13]。非手术的内窥镜法在腹部的开口小，子宫、输卵管和卵巢不会全部暴露，不会引起子宫粘连，也可减少手术损伤[14]，而且对子宫体结合部位的组织牵引较轻微，对胚胎发育和着床影响甚微，与手术法相比可显著提高受胎率[11]。目前，为重复使用受体羊，避免造成受体羊子宫粘连，加快手术时间，已放弃手术法移植，而逐步采用非手术法移植，即利用腹腔内窥镜与子宫钳的配合，无需切开腹腔进行移植的方法。此外，操作者的技术水平也至关重要[15]，需熟练掌握整个手术过程，还应具有严格的无菌意识，将对羊的伤害降到最小。

3 母体因素

3.1 供体羊

供体绒山羊母羊品质是胚胎移植能否成功一个非常重要的因素[16]，应具备遗传优势、育种价值。供体母羊生产性能优异，产绒量高，遗传性能稳定；体质健康，体况适中，发情周期和生殖功能均正常，无生殖系统疾病。选择2~5 周岁的经产母羊为宜，系谱要记录准确、膘情适中，最好连续观察2个正常发情周期以上。常规要求是在超排处理前15 d 内不进行免疫，单独组群饲养，避免发生应激反应[6]。在日常生产中，为充分利用种质资源，没有繁殖问题的老龄优质母羊在淘汰前可作为供体进行超排，虽超排效果略差，但从胚胎利用方面考虑相对合算。

3.2 受体羊

受体绒山羊发情周期和繁殖性能正常[5]，体型中上等，体质良好，母性和泌乳性能好，对化学物质反应敏感，年龄2~5 周岁，且健康无传染性疾病，体况良好，以经产母羊为宜。连续观察到2个以上的正常发情，同期发情处理前不做免疫和应激处理，尽量单独饲养。切勿将体况差的母羊列为受体羊，因为经过同期发情处理、移植手术后，母羊的受胎率低，且易出现流产，影响生产效率。

3.3 供、受体羊前期饲养管理

供体羊与受体羊处理前1 个月内，可按饲养标准投喂饲料，最好补饲胡萝卜避免应激[5]。供体羊在采卵前应保证良好的饲养条件[17]，粗饲料以优质苜蓿草为主，同时补充高蛋白饲料、维生素和矿物质（可放置舔砖），并供给清洁的饮水及盐。圈舍应卫生、干燥、温度适宜，避免造成应激反应[18]。受体羊除保证常规的饲养方法外，术前应提前补饲充足的维生素及微量元素，保证良好的体况[19]。此外，供体和受体羊的同期发情水平也是影响胚胎移植的关键因素。同期发情是使供受体羊排卵同期化[20]，同期化程度越高，移植的成功率越高[21]。通常在供受体羊开始同期发情处理时肌注维生素A、维生素D、维生素E 注射液，以保证每只羊充分获得所需的维生素。

3.4 受体羊的发情状况

制定移植计划时，供受体羊的配比通常约1∶4[22]，因供体在超排激素待诱导下，通常可达到适宜的排卵效果。受体羊的发情与供体羊的同步率将直接影响移植效率。受体羊的发情鉴定以稳定接受试情公羊爬跨为准，并记录发情时间。此外，发情的受体母羊被挑出后，其他母羊需早、中、晚共3次试情，以利于及时筛出发情羊与供体羊匹配。

3.5 供、受体羊移植后饲养管理

移植后应注重营养全面供给，制定合理的饲料配方，尤其注重蛋白质需求，加强蛋白质供应[23]，保证胚胎着床和充分发育。术后受体羊应选择卫生条件比较好的圈舍，生活环境安静、温度适宜，最好单独饲养，避免一些不良因素刺激引发流产[24]。供、受体羊术后观察24 h后方可跟群放牧，须仔细观察羊，若出现卧地不起、弓腰努责或不进食不排粪的现象应及时处理。术后不要立即饲喂精料，只喂新鲜干草及清洁的饮水，最好是加盐的温水[25]。术后1 周内，恢复术前常规精料饲喂量，移入胚胎的受体羊应继续喂胡萝卜，补充足够的维生素，满足母体及胎儿的需要。

受体羊术后1~2个情期内应专人观察返情情况，若返情则应进行配种或列为下一次移植对象。未返情的羊应防止发生争斗，加强饲养管理，注意满足蛋白质的补充。妊娠的中后期注意全面加强营养供应，以满足胚胎快速发育的需求。大量研究表明，受体羊摄入维生素不足时会对前期的胚胎着床造成不利影响，显著影响受体羊胚胎移植的效果，甚至会对产后羔羊的生长造成负面影响[12]。因此为保证较好的移植效果，必须要做好受体羊的饲养管理。

4 其他因素

4.1 胚胎因素

母羊受精后要对胚胎进行收集。胚胎活力会受到物理、化学和微生物等因素的影响，因此应对收集到的胚胎进行检查，筛出合格的具有发育能力的胚胎用于移植[26]。结合胚胎的发育状态进行分级，选择进行移植或保存。一般胚胎可分为4 个等级[27]，1 级胚胎即为优秀胚，发育正常，胚龄与发育阶段吻合，卵裂球轮廓清楚，细胞团发育良好，细胞变性率不超过10%；2 级胚胎即为良好胚，发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗、稍浅，细胞密度较小或小型卵裂球过多，有小部分突出细胞和水样细胞，细胞变性率为10~20%；3级胚胎即为一般胚，轮廓不清晰，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一半多，细胞变性率为30~40%；4 级胚胎即为不可用胚，指未受精卵和变形卵。1、2级胚胎可用于冷冻，3级可用于鲜胚移植。

4.2 季节因素

绒山羊的发情受光照和温度影响，繁殖季节主要是集中在秋季，季节性明显[28]。杨舁等[29]研究对不同季节受体母羊的妊娠率进行了对比，结果发现在10 月至12 月妊娠率最高。因此，为提高绒山羊胚胎移植的受胎率，胚胎移植的日程尽量选在秋冬两季进行，早春次之，夏季最差。母羊卵巢在繁殖季节处于活动状态，卵泡才能够发育、成熟，羊表现出正常发情[30]。因此，绒山羊的胚胎移植时间应根据当地的光照和温度及羊的发情状况选择。此外，温度过高会对母羊卵子的发育、受精、胚胎发育和着床产生影响，因此秋季到初春这段时间最合适[5]。而严寒、酷热均会对羊造成应激，这些生理上的不良影响会作用于生殖内分泌轴，从而影响发情和排卵。

5 展望

胚胎移植是羊繁殖领域的一项重要技术，是体外受精、幼龄母羊早期利用（JIVET）、核移植（克隆）、转基因等技术的应用基础，也是胚胎工程技术中的最基本技能操作。通过胚胎移植技术可充分发挥优质绒山羊母羊的繁殖潜力，经超数排卵生产更多的优良母羊后代，缩短母羊的繁殖周期，尽早开展后裔生产性能测定、评价种公羊的种用价值，经增强选择强度缩短育种进程。此外，胚胎移植能够使优良不孕的母羊生产后代，对于存在内分泌缺陷或生殖系统障碍的优良母羊则可通过胚胎移植发挥优良种质作用。

绒山羊的胚胎移植技术在一些规模绒山羊场的生产实践中已有一定的应用和推广，但受绒山羊种羊价格的影响尚未达到产业化应用阶段。目前，胚胎移植过程中受到各种因素的影响，绒山羊移植后的受胎率略低于绵羊。随着对上述多种影响因素进行深入的研究和探索，胚胎移植技术未来能够在绒山羊的生产实践中发挥作用。