HPLC-MS/MS测定油菜花蜂蜜中20种磺酰脲类除草剂

田亚，张淑霞，孙转莲，王向军

郑州海关技术中心（郑州 450016）

油菜是我国优质的蜜源植物，油菜田间的杂草以化学防除为主[1-2]。磺酰脲类除草剂被目前各国广泛应用，且使用量较高，对于油菜田中的阔叶及禾本科杂草具有较好的防治效果[3]。大多数磺酰脲类除草剂属于长残效除草剂，其在农作物中的残留会对农作物造成多种危害，且残留物通过环境进入食物链，对人类具有潜在风险和毒性[4-5]。油菜花蜂蜜除含有丰富的维生素、果糖以外，还有大量黄酮，长期食用能够促进胃肠道消化、排毒养颜、提高免疫力、保护心血管、预防动脉粥样硬化，是日常普遍食用和保健的天然产品。蜜蜂在油菜花田采蜜，会将大量除草剂残留物传递到油菜花蜂蜜中，对人类健康产生威胁。因此，建立一种检测油菜花蜂蜜中磺酰脲类除草剂残留方法对于食品安全问题具有重要价值及影响意义。

近年来，对于磺酰脲类除草剂残留量的检测方法主要有气相色谱法[6]、高效液相色谱法[7-9]和液相色谱-串联质谱法[10-14]。采用气相色谱法分析时，由于磺酰脲类除草剂具有强极性、高沸点的特性，需要进行衍生化处理，其操作繁杂，不适合日常多残留的快速检测。采用高效液相色谱法分析时，由于液相色谱的选择性差，蜂蜜除了主要成分果糖、葡萄糖和水分外，还含有一些蛋白质、氨基酸、有机酸、多酚类物质和维生素等，基质较为复杂，当目标物检测数量多时，分离难度大，容易导致干扰物与目标待测物同时出峰，造成干扰，且许多国家对磺酰脲类除草剂的最大残留限量规定较低，高效液相色谱法灵敏度达不到限量要求。液相色谱-串联质谱法选择性高、灵敏度强、稳定性好、抗干扰能力突出，因此可作为分析磺酰脲类除草剂残留量的优选方法[15]。关于同时测定油菜花蜂蜜中多种磺酰脲类除草剂的方法尚未有报道。试验采用QuEChERS方法进行净化处理，高效液相色谱-串联质谱法测定油菜花蜂蜜中20种磺酰脲类除草剂的残留量，该方法操作简便快捷、灵敏度高、准确性好，可为蜂蜜中农药残留的快速测定和风险评估提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酰嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧磺隆、氟吡磺隆、氯吡嘧磺隆、甲基碘磺隆、甲基二磺隆、嗪吡嘧磺隆、甲磺隆、嘧苯胺磺隆、丙嗪嘧磺隆、吡嘧磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆标准品（质量分数均＞97%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化炭黑（GCB）：美国Agilent公司。

乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克）；甲酸（色谱纯，美国ACS）；无水MgSO4、氯化钠（分析纯，天津科密欧）；甲酸铵（色谱纯，天津科密欧）；有机滤膜（0.22 μm，美国PALL）；水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；油菜花蜂蜜（购于郑州市各大超市，于20 ℃保存）。

1.1.2 仪器与设备

高效液相色谱-串联四极杆质谱仪[LC-MS/MS，安捷伦6470（配Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色谱），美国Agilent公司]；电子天平（感量0.01 mg，MettLer ToLedo，XPE105-S/FACT）；台式高速冷冻离心机（5427 R，德国Eppendorf公司）；氮吹仪（N-EVAP 112，美国Organomation公司）；Heidolph multi reax多功能振荡器（德国heidolph公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 标准储备液（1 000 μg/mL）

分别准确称取适量的20种磺酰脲类除草剂标准品，用乙腈溶解并定容，分别得到质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备液（折算每种标准品的纯度），在-18 ℃条件下储存。

1.2.1.2 混合标准中间液（10 μg/mL）

分别准确移取适量各标准储备液于容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，得到10 μg/mL的混合标准中间液，在-18 ℃条件下储存。

1.2.1.3 基质混合标准曲线

将混合标准中间液（10 μg/mL）根据需求稀释，得到1 μg/mL的混合标准工作液，以阴性蜂蜜样品提取液配制质量浓度为0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的标准溶液，进行测定并绘制标准曲线。

1.2.2 样品前处理

对于未结晶的油菜花蜂蜜样品，将其混匀。对于有结晶的油菜花蜂蜜样品，在密闭条件下低于50 ℃水浴中温热，振荡，待样品全部融化后混匀，放置室温冷却。

精密称取2.00 g混匀后的蜂蜜于50 mL离心管中，加入5 mL水稀释，涡旋混匀2 min，加入10 mL 1%甲酸乙腈和5.0 g氯化钠，旋涡混匀2 min，以4 000 r/min离心5 min，准确量取5.0 mL上层提取液至含有50 mg PSA和25 mg C18吸附剂的50 mL离心管中，旋涡混匀2 min，以4 000 r/min离心5 min，过有机滤膜后供LCMS/MS测定。

1.2.3 LC-MS/MS分析

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；流动相B相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；A相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液；流量0.3 mL/min；进样量5 μL；流动相梯度洗脱条件见表1。

1.2.3.2 质谱条件

离子源，电喷雾ESI；正离子；扫描方式采用多反应监测MRM；干燥气流速350 ℃；干燥气温度10 L/min；雾化气压力276 kPa；鞘气流速11 L/min；鞘气温度375 ℃；毛细管电压3 500 V。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

分别进行电喷雾ESI+、ESI-模式扫描，结果发现[M+H]+的加合离子信号高且稳定，故20种磺酰脲除草剂均为ESI+模式扫描。优化每个母离子对应的最优裂解电压，进而得到强弱不同的子离子碎片，施加不同的碰撞能量以得到最佳丰度的离子，丰度值最高的离子对为定量离子，次级丰度值的离子对为定性离子。同时在MRM模式下对鞘气温度及流速、干燥器温度及流速、毛细管电压等参数做进一步优化，从而获得最优质谱条件。20种化合物的质谱参数见表1。

表1 20种目标物的质谱参数及色谱保留时间

接表1

2.2 色谱条件优化

由图1和图2可知，方法中20种磺酰脲类除草剂的峰形及分离效果较好，通过对色谱条件进行优化，选择液相色谱常用的甲醇和乙腈两种有机溶剂，由于磺酰脲类除草剂为弱酸性化合物，在甲醇、乙腈中分别加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸铵，可明显提高电喷雾离子化效率，通过对比发现0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵甲醇溶液比0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵乙腈溶液对20种磺酰脲类除草剂分离效果更充分，响应值更高。同时考察0.01%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液、0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液及0.01%氨水作为流动相的分离情况，通过对比0.01%氨水分离效果较差，0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液质谱响应值最高，且目标物峰形及保留时间重现性均较好。故试验选用0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液与0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸铵甲醇溶液作为流动相。另外，为使20种磺酰脲类除草剂的分离效果达到最佳，进而优化流动相洗脱条件，结果见表2。

表2 流动相梯度洗脱条件

图1 20种目标物总离子流色谱图

图2 20种目标物定量离子色谱图（10 μg/L）

2.3 前处理方法的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

在油菜花蜂蜜样品中加入水溶解稀释，通过有机试剂进行提取，可起到去除一定糖分的作用。磺酰脲类除草剂具有弱酸性，在酸性条件下从水相中提取到有机相较为容易，故通过加标回收对比甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈对目标待测物的提取效果。由图3可知，以甲醇、1%甲酸甲醇为提取液时，由于甲醇不能与水分层，20种目标待测物除醚磺隆外，其余化合物的回收率均低于60%，提取效果较差，其中甲磺隆、苯磺隆、氯磺隆回收率分别为11.3%，12.48%和17.48%，提取效果最差。以乙腈为提取液时，目标化合物的回收率为52.77%～91.94%，提取效果显著提高。以1%甲酸乙腈为提取液时，回收率为64.91%～101.81%，由于磺酰脲类除草剂在结构和体系的pH影响下容易水解，乙腈中加入1%甲酸能够有效提高易水解目标物的稳定性，进而提高待测目标物的提取效果。

图3 20种磺酰脲类除草剂在4种溶剂提取下的回收率（加标10 μg/kg）

2.3.2 净化方法的选择

QuEChERS净化方法是运用不同的吸附剂与样品中杂质相互作用，从而实现净化目标化合物的效果，具有快速、简便、高效、使用范围广等优点，适用于极性、非极性、高酸碱性等化合物，常用的吸附净化剂有乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化炭黑（GCB）和无水硫酸镁[16]。由图4可知，分别采用PSA（50 mg）、C18（50 mg）、GCB（50 mg）和无水硫酸镁（50 mg）对5 mL提取液进行净化时，GCB和无水硫酸镁净化效果较差，部分目标化合物回收率低于60%，净化效果差异较大，且GCB对乙氧磺隆和苄嘧磺隆有明显吸附效应。PSA和C18对目标待测物的净化效果显著，PSA可以去除蜂蜜样品中的葡萄糖、果糖、有机酸、多酚类等极性物质，C18可以吸附蜂蜜样品中的蛋白质、芳香物质中的酯类等非极性物质。为进一步优化净化剂使用量，进而采用PSA和C18不同的配比组合进行试验，由图5结果可知，并不是PSA和C18添加量越多越好，随着PSA和C18添加量增加，目标待测物的回收率普遍呈下降趋势，PSA添加量50 mg，C18添加量25 mg时目标待测物回收率为77.5%～104.18%，其净化效果最好。

图4 20种磺酰脲类除草剂在4种净化剂下的回收率（加标10 μg/kg）

图5 20种磺酰脲类除草剂在PSA和C18不同使用量下的回收率（加标10 μg/kg）

2.4 工作曲线、检出限和定量限

以阴性样品的提取液配制目标待测物质量浓度为0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的标准工作液，以待测物浓度为横坐标，其对应峰面积为纵坐标绘制校准曲线。由表3可知，20种目标化合物分别在各自的线性范围内呈良好关系，相关系数（r）均＞0.999 1。方法灵敏度采用低水平阴性样品加标来测试，检出限以信噪比（rSN＞3）所对应的加标浓度计，为0.5～1.0 μg/kg；定量限以信噪比（rSN＞10）所对应的加标浓度计，为1.0～2.5 μg/kg。

表3 线性方程、检出限和定量限

2.5 方法回收率与精密度

准确称取阴性油菜花蜂蜜样品，分别添加10，50和100 μg/kg质量分数水平的20种磺酰脲类除草剂的标准混合液，采用上述方法进行样品加标回收处理，每个浓度水平分别进行6个平行试验，计算加标回收率及测定值的SRSD，结果见表4。计算所得加标平均回收率为77.9%～104.1%，SRSD均小于10%，该方法的回收率与精密度较好。

表4 20种磺酰脲类除草剂的加标平均回收率及SRSD（n=6）

2.6 实际样品检测

从超市选购6个油菜花蜂蜜，采用试验方法对样品进行测定，结果显示，20种磺酰脲类除草剂均未检出，且样品谱图无干扰峰，表明油菜花蜂蜜中检出磺酰脲除草剂的风险较低，具有较高的安全性。

3 结论

通过对质谱条件、液相色谱条件及前处理方法进行优化，建立一种QuEChERS-LC-MS/MS测定油菜花蜂蜜中20种磺酰脲类除草剂残留量的分析方法，并验证线性范围、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率、精密度等方法学指标。方法操作简单快捷，具有较高的灵敏度、准确度和精密度，且尚未有对蜂蜜中磺酰脲类除草剂残留量的风险评估报道，为建立蜂蜜中磺酰脲类除草剂残留量的检测方法提供数据支撑，并为其批量筛查和风险监测提供参考。