沙棘异功方中总黄酮的纯化及抗氧化活性研究

万鹏聪，张俊，杜晨晖，梁惠珍，裴香萍

山西中医药大学 中药与食品工程学院（晋中 030619）

沙棘异功方是以《小儿药证直诀》中的经典方“异功散”为基础，由沙棘、炙甘草、陈皮、党参、炒白术、茯苓等药味组成，具有健脾消食、行气化滞、止咳祛痰的功效，临床用于治疗因小儿脾胃气虚引起的食积、厌食、咳嗽等症。方中多数药味所含的总黄酮成分具有良好的抗氧化能力[1-8]。而且益气健脾中药（如党参、甘草）中的黄酮类成分对修复胃肠黏膜损伤有较好的药理活性，可用于治疗胃肠疾病[9]。沙棘中的黄酮类成分（如原花青素类）对应激性胃溃疡具有保护作用[10]。广陈皮中的多甲氧基黄酮类化合物（如川陈皮素和橘皮素）能够增强肠蠕动，具有促消化功能[11]。文章采用大孔树脂吸附法对沙棘异功方水提取物中的总黄酮进行分离纯化，并比较分析大孔树脂纯化前后总黄酮的抗氧化能力，为后续有效部位的药效学试验研究提供理论依据，也为以该复方为基础研发的相关制剂研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CP214分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；ALC-210.4电子分析天平（上海精密仪表有限公司）；HH-2恒温水浴箱（金坛市杰瑞尔有限公司）；BGZ-30数显鼓风干燥箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；SB-800 DTD超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Ultra-3660型紫外可见分光光度计（北京普源精电科技有限公司）。

1.2 药材与试剂

炙甘草、党参、陈皮（山西元和堂中药有限公司）；炒白术、茯苓（山西维康堂中药饮片有限公司）；沙棘（新疆塔城诚信药业），由山西中医药大学中药鉴定教研室的裴香萍教授鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2020年版一部项下规定。芦丁对照品（批号：100080-202012，中国食品药品检定研究院）。

无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）；亚硝酸钠（天津市凯通化学试剂有限公司）；硝酸铝（天津市天力化学试剂有限公司）；氢氧化钠（天津市北辰方正试剂厂）；邻二氮菲、硫酸亚铁（天津科密欧化学试剂有限公司）；双氧水（天津市风船化学试剂科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海伊卡生物技术有限公司）；2, 6-二叔丁基对甲酚（BHT，北京索莱宝科技有限公司）；磷酸缓冲溶液（PBS溶液，北京索莱宝生物科技有限公司）；水为蒸馏水，试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备

取5.15 mg芦丁对照品，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

按照处方比例称取36 g沙棘、24 g炙甘草、24 g陈皮、24 g党参、24 g炒白术、24 g茯苓，加10倍量水，煎煮2次，每次30 min，滤过，合并滤液，浓缩，浓缩液置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再精密量取500 mL，置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.1.3 标准曲线的制备[12]

精密量取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL对照品溶液，分别置10 mL带塞试管中，各加水至2.4 mL，加0.4 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，加0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min，加4 mL 4% NaOH溶液，再加2.8 mL水，摇匀，放置15 min，以第1支试管为空白，在500 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程：y=9.621 8x+0.137，r=0.998 4。说明芦丁在0.008～0.049 mg/mL内，线性关系良好。

2.1.4 精密度试验

精密吸取1.2 mL芦丁对照品溶液，置10 mL带塞试管中，按标准曲线项2.1.3小节操作，在500 nm处测定吸光度，平行测定6次，结果显示：吸光度的SRSD为0.26%（n=6）。表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

精密吸取0.2 mL供试品溶液，置10 mL带塞试管中，按标准曲线项2.1.3小节操作，分别在0，30，60，90，120和150 min测定吸光度。结果显示：吸光度的SRSD为2.14%（n=6）。表明供试品溶液在150 min内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验

按照处方比例称取适量各复方药材，共6份，按照2.1.2小节中供试品溶液的制备方法制备，精密吸取0.2 mL，置10 mL的带塞试管中，按照标准曲线项2.1.3小节操作，在500 nm处测定吸光度，计算复方药材中总黄酮含量。结果显示：平均含量为13.05 mg/g（n=6），SRSD为1.85%（n=6）。说明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验

按照处方比例称取1/2量的重复性试验所使用的复方各药材，共6份，再加入10.0 mg芦丁对照品，按照2.1.2小节中供试品溶液的制备方法制备，再精密吸取0.2 mL供试品溶液，置10 mL的带塞试管中，按照标准曲线项2.1.3小节操作，在500 nm处测定吸光度，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.1.8 样品测定

按照处方比例称取适量各复方药材，共3份，按照2.1.2小节中供试品溶液的制备方法制备，精密吸取0.2 mL，置10 mL的带塞试管中，按照标准曲线项2.1.3小节操作，在500 nm处测定吸光度，计算复方药材中总黄酮含量。结果显示，总黄酮含量为12.85，13.37和13.51 mg/g。

2.2 总黄酮的纯化工艺研究

2.2.1 大孔树脂的预处理[13]

将大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后用水洗至无醇味，然后用5% HCl溶液浸泡2～3 h，用水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡2～3 h，最后用水洗至中性，备用。

2.2.2 大孔树脂的选择

分别精密称取已处理好的5种大孔树脂，各1 g，置100 mL具塞三角瓶中，分别精密加入20 mL供试品溶液，室温下放置吸附24 h，不时振摇，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，摇匀。再精密吸取2 mL至10 mL具塞试管中，按照标准曲线的制备方法制备，在500 nm处测定吸光度，计算总黄酮的吸附率[14]。将吸附试验抽滤后的大孔树脂放入100 mL具塞三角瓶中，加30 mL 60%乙醇进行洗脱，室温下放置解吸24 h，不时振摇，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，再精密吸取2 mL置10 mL具塞试管中，按照标准曲线的制备方法制备，在500 nm处测定吸光度，计算总黄酮解析率[14]。结果见表2。通过分析，选择DM301型大孔树脂进行纯化。

表2 大孔树脂筛选结果 单位：%

2.2.3 上样浓度的考察

将5 g已处理好的DM301型大孔树脂装入色谱柱（内径为1.3 cm）中，共5份，分别加入质量浓度为0.553，1.106，1.659，2.212和2.765 mg/mL的供试品溶液，各30 mL，以流速2 mL/min进行吸附，之后用水洗至流出液无色，合并收集到的流出液，按2.1.3小节的方法进行制备，测定吸光度，计算吸附率。结果见图1。质量浓度为2.212 mg/mL时，吸附率为60.89%，达到最大，故上样质量浓度选择2.212 mg/mL。

图1 上样浓度的考察

2.2.4 上样体积的考察

将5 g已处理好的DM301型大孔树脂装入色谱柱（内径为1.3 cm）中，加入供试品溶液（质量浓度为2.212 mg/mL），以流速2 mL/min进行吸附，收集流出液，每5 mL收集1份，按2.1.3小节的方法进行制备，测定吸光度，计算流出液中总黄酮的泄漏量。结果见图2。总黄酮泄漏量随着上样体积的增加逐渐增多，当上样体积从25 mL增加至30 mL时，泄漏量从6.168 3 mg迅速上升至14.420 4 mg，树脂达到饱和吸附，为了减少总黄酮的损失，故上样体积选择25 mL（质量浓度为2.212 mg/mL）。

图2 上样体积的考察

2.2.5 上样流速的考察

9、《关于进一步落实重点群体创业就业税收政策的通知》。11月23日，为支持和促进重点群体创业就业，财政部、税务总局、人力资源社会保障部财政部等三部门下发《关于进一步落实重点群体创业就业税收政策的通知》（财税〔2018〕136号），就政策落实提出具体要求。

将5 g已处理好的DM301型大孔树脂装入色谱柱（内径为1.3 cm）中，共5份，分别加入25 mL供试品溶液（质量浓度为2.212 mg/mL），以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min进行吸附，之后用水洗至流出液无色，合并收集到的流出液，按2.1.3小节的方法进行制备，测定吸光度，计算吸附率。结果见图3。流速为1.0 mL/min时总黄酮的吸附率最大，故选1.0 mL/min作为最佳上样流速。

图3 上样流速的考察

2.2.6 洗脱溶剂的考察

将5 g已处理好的DM301型大孔树脂装入色谱柱（内径为1.3 cm）中，共5份，分别加入25 mL供试品溶液（质量浓度为2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min进行吸附，之后用水洗至流出液无色，再分别加入30 mL 20%，40%，60%，80%和95%乙醇，以流速2.0 mL/min进行洗脱，收集洗脱液，按2.1.3小节的方法进行制备，测定吸光度，计算解吸率。结果见图4。80%的乙醇洗脱时解吸率最大，因此选用80%乙醇作为洗脱剂。

图4 洗脱溶剂的考察

2.2.7 洗脱流速的考察

将5 g已处理好的DM301型大孔树脂装入色谱柱（内径为1.3 cm）中，共5份，分别加入25 mL供试品溶液（质量浓度为2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min进行吸附，之后用水洗至流出液无色，再加入30 mL 80%乙醇，分别以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min进行洗脱，收集洗脱液，按2.1.3小节的方法进行制备，测定吸光度，计算解吸率。结果见图5。流速在3 mL/min时，解吸率达到最大，因此选3 mL/min为最佳洗脱流速。

图5 洗脱流速的考察

2.2.8 洗脱剂体积的考察

图6 洗脱剂体积的考察

2.2.9 工艺验证

按照上述最佳纯化工艺条件进行装柱、上样、洗脱、收集洗脱液、回收乙醇、减压干燥，即得纯化后干膏。取适量供试品溶液（质量浓度为2.212 mg/mL），浓缩，减压干燥，即得纯化前干膏。分别精密称取适量纯化前、后干膏，各3份，测定吸光度，计算总黄酮含量。由结果可知：纯化前干膏中总黄酮含量分别为5.20%，5.44%和5.78%，平均含量为5.47%（n=3）；纯化后干膏中总黄酮含量分别为48.10%，53.28%和54.33%，平均含量为51.90%（n=3）。

2.3 总黄酮的抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定

精密称取5 mg DPPH置100 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解，并定容至刻度，避光备用。分别精密吸取2 mL不同浓度的BHT乙醇溶液和纯化前、后的样品溶液（20，40，60，80和100 μg/mL），加2 mL DPPH溶液，混匀，放在暗处反应30 min，在500 nm处测定吸光度，计算清除率。以2 mL水加2 mL DPPH溶液为控制样本，BHT乙醇溶液为阳性对照，50%乙醇为空白。DPPH自由基清除率按式（1）计算[15]。

式中：A0为控制样本的吸光度；As为测量样本的吸光度。

清除DPPH自由基的能力用EC50表示，EC50越小，DPPH清除率越高，清除效果越好。由图7可得，随着总黄酮的浓度逐渐升高，消除率逐渐变大。BHT乙醇溶液清除DPPH自由基的能力EC50为80.57 μg/mL，沙棘异功方水提取物中总黄酮纯化前的EC50为80.95 μg/mL，和BHT清除率基本相当；纯化后的EC50为52.91 μg/mL，说明明显高于BHT清除率。

图7 DPPH自由基清除能力测定

2.3.2 羟自由基清除能力测定

精密称取0.150 1 g邻二氮菲，置100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度；精密称取0.204 7 g硫酸亚铁，置100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；精密吸取0.33 mL双氧水，置10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，避光备用。分别精密吸取0.4 mL不同浓度的BHT乙醇溶液和纯化前、后的样品溶液（0.5，1.0，1.5，1.8和2.0 mg/mL），加2 mL PBS溶液、0.2 mL邻二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亚铁溶液，混匀，于37 ℃水浴1 h，在536 nm处测定吸光度A样；取2 mL PBS溶液、0.2 mL邻二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亚铁溶液、4.6 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm处测定吸光度A空；取2 mL PBS溶液、0.2 mL邻二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亚铁溶液、0.4 mL双氧水溶液、4.2 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm处测定吸光度A损；取2 mL PBS溶液，5 mL水为校零。BHT乙醇溶液为阳性对照。羟自由基清除率按式（2）计算[16]。

式中：A样为样品的吸光度；A空为空白的吸光度；A损为损伤的吸光度。

清除羟基自由基的能力用EC50表示，EC50越小，羟基自由基清除率越高，清除效果越好。由图8可得，随着总黄酮的浓度逐渐升高，消除率逐渐变大。BHT乙醇溶液清除羟基自由基的能力EC50为1.29 mg/mL，沙棘异功方水提取物中总黄酮纯化前清除羟基自由基的能力EC50为2.04 mg/mL，明显低于BHT清除率；纯化后的EC50为1.51 mg/mL，略低于BHT清除率。

图8 羟基自由基清除能力测定

3 结论与讨论

在预试验中比较了大孔树脂和聚酰胺对沙棘异功方水提取物中总黄酮的分离纯化效果，结果采用大孔树脂纯化后的总黄酮含量较高，故选用大孔树脂作为吸附剂。之后对不同型号的大孔树脂（D101、HNK-9、AB-8、DM301、HPD600）的分离纯化能力进行了比较分析，最终选择DM301型作为试验树脂。通过动态吸附和解吸附影响因素的考察，得出大孔树脂纯化沙棘异功方水提取物中总黄酮的最佳纯化工艺：上样体积为25 mL（质量浓度为2.212 mg/mL），上样流速为1 mL/min，用80%的乙醇50 mL进行洗脱，洗脱流速为3 mL/min。纯化前总黄酮含量为5.47%，纯化后总黄酮的含量为51.90%，纯度提高了9.49倍。

文章还比较分析了沙棘异功方水提取物中总黄酮在大孔树脂纯化前后的抗氧化能力，结果显示：总黄酮纯化前清除DPPH自由基的能力EC50为80.95 μg/mL，纯化后的EC50为52.91 μg/mL；总黄酮纯化前清除羟基自由基的能力EC50为2.04 mg/mL，纯化后的EC50为1.51 mg/mL。说明纯化后沙棘异功方水提取物中总黄酮在纯度提升的同时，抗氧化能力也有所增强，说明DM301型大孔树脂能够用于分离纯化沙棘异功方水提取物中的总黄酮。