非商品枇杷茶中绿色素提取工艺优化及其稳定性研究

张莉，尹翔东，毛鹏煜，席阳红，杨朝林，颜麟沣

1. 四川省食品发酵工业研究设计院（成都 611130）；2. 四川省茶叶集团股份有限公司（宜宾 644007）

近年来，随着人们生活水平的提升，消费者对于绿色健康生活的追求日益增加，色素的使用受到越来越多的关注。相对于合成色素，从天然产物中提取的天然色素不仅能够提供着色作用，还具备一定生理活性，有利于消费者健康，因此天然色素提取成为热点关注的话题。茶绿色素是从鲜茶叶或者绿茶中提取的一种天然色素成分[1-3]，其中主要包含叶绿素及叶绿素铜钠盐、黄酮醇、儿茶素、咖啡碱、氨基酸、维生素等活性物质[4-6]，研究表明其具有调节血糖、血脂、抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗氧化等功效[7-9]，被广泛应用于食品加工、医药保健以及日化等领域[10-12]，具有广阔的市场空间。

枇杷茶是四川省五大良种茶之一，也是我国珍贵又稀少的茶品种，因其茶叶与枇杷叶相似而得名[13]。该品种茶具有肉厚、味浓、耐光、高香等特点，其叶片肥厚，富含绿色素成分，除制作琵琶茶叶售卖外，其残叶、老叶及淘汰鲜叶等非商品茶可作为绿色素提取的优质原料，是提高茶叶附加值的有效途径。对于枇杷茶绿色素提取工艺尚未有相关报道。试验以枇杷茶为原料，采用超声辅助溶剂法提取其绿色素，研究提取工艺以及其稳定性，以期为枇杷茶绿色素工业化生产提供技术支撑与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

非商品枇杷茶（采自四川省成都市都江堰市青城山镇茶坪社区）。

氯化钠、无水乙醇、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、氯化铜、氯化铝（均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

1.2 仪器与设备

XL-400B多功能粉碎机（永康市小宝电器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；KQ5200DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；美谱达UV-6100型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；5804R离心机（德国Eppendorf公司）；AKHL-Ⅲ-24超纯水机（成都康宁试验专用纯水设备厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 绿色素的提取工艺

茶叶→干燥（50 ℃）→粉碎→过筛（0.425 mm孔径筛，40目）→加入乙醇→超声提取→减压抽滤→色素提取液

1.3.2 提取液的制备

将采摘的残叶、老叶及淘汰枇杷茶鲜叶放入烘箱，在50 ℃条件下进行烘干后用粉碎机打粉，茶粉过0.425 mm孔径（40目）筛，备用。称取1 g茶粉，按固液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇，超声温度定为60℃，时间定为60 min，进行色素超声提取，提取液通过减压抽滤后，在3 000 r/min条件下离心10 min，再次使用80%乙醇溶液稀释后即为提取液。

1.3.3 提取液的紫外可见光谱

取一定量的提取液放置于比色皿中，用80%乙醇作为空白对照，用紫外-可见分光光度计进行扫描，扫描波长范围为550～800 nm，结果见图1。最大吸收波长666 nm，与文献[14-15]的结果基本一致，表明提取物为茶绿色素，后续试验吸光度均在666 nm处进行测定。

图1 茶提取液的紫外可见光谱

1.3.4 绿色素提取单因素试验

在提取剂一定的条件下，分别考察不同乙醇体积分数（60%～100%）、固液比（1∶5～1∶25 g/mL）、超声功率（200～600 W）、超声时间（30～70 min）和超声提取温度（40～80 ℃）对吸光度的影响。

1.3.5 正交试验

选取影响绿色素提取的5个主要条件，即乙醇体积分数、固液比、超声功率、超声时间、提取温度为试验因素，采用L16(45)正交试验，以吸光度为评价指标，确定最佳提取工艺，正交试验设计表见表1。

表1 绿色素提取正交因素水平表

1.3.6 绿色素稳定性测定

1.3.6.1 温度对色素稳定性的影响

取1 mL茶绿色素提取液，分别在室温，40，60，80和100 ℃水浴温度下放置30 min后，冷却至室温，测定其在666 nm处的吸光度，通过对比不同条件下吸光度研究其热稳定性[16]。

1.3.6.2 pH对色素稳定性的影响

取1 mL茶绿色素提取液，分别用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液调节pH为3，5，7，9和11，并定容至50 mL，避光放置1 h后测定其在666 nm处的吸光度，通过对比不同条件下吸光度研究pH对其稳定性的影响[17]。

1.3.6.3 金属离子对色素稳定性的影响

取1 mL茶绿色素提取液，分别加入1 mL的0.1 mol/L浓度的K+、Na+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Fe3+金属离子溶液，定容至50 mL，摇匀并置于冰箱4 ℃条件下静置24 h后测定其在666 nm处的吸光度，通过对比不同条件下吸光度的变化研究金属离子对其稳定性的影响[18]。

2 结果与讨论

2.1 不同乙醇体积分数对茶绿色素提取的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，吸光度呈先上升后下降趋势，乙醇体积分数在80%～90%范围内提取率较高，说明绿色素的极性与此体积分数范围乙醇的极性接近。叶绿素是茶绿色素中的主要成分，其亲水基团能与水结合，绿色素溶于水中，但提取剂中水分较低时，叶绿素亲水基团较难与蛋白质分离，无法从茶叶类囊膜体中游离，因此提取率降低。乙醇体积分数80%和90%时，绿色素提取率差异不显著，但是考虑实际操作过程中能耗与成本因素，选用80%乙醇为宜。

图2 乙醇体积分数对茶绿色素吸光度的影响

2.2 固液比对茶绿色素提取的影响

由图3可知，随着固液比的下降，吸光度呈现增大趋势。这是由于固液比下降，有助于乙醇对细胞膜的渗透，提高绿色素的溶解。固液比1∶20（g/mL）时，茶绿色素几乎被完全提取，继续提高提取剂用量时，吸光度增加缓慢。综合考虑生产成本因素，选用固液比1∶20（g/mL）为宜。

图3 固液比对茶绿色素吸光度的影响

2.3 超声功率对茶绿色素提取的影响

由图4可知，随着超声功率的升高，吸光度逐渐上升，但功率超过500 W后，吸光度降低，此现象可能是由于超声功率达到一定程度后，引起温度升高过快，茶绿色素破坏损失，导致吸光度降低。而超声功率未达到500 W时，随着超声功率的增加，绿色素能够更好地从细胞中游离出来，易于被乙醇溶液萃取。因此，超声功率500 W时吸光度最高。

图4 超声功率对茶绿色素吸光度的影响

2.4 超声时间对茶绿色素提取的影响

由图5可知，随着超声时间的延长，吸光度先上升，时间超过60 min时，吸光度开始降低。这可能是因为短时间的超声处理无法有效破坏细胞，溶出物较少，吸光度增加速度缓慢。随着时间的延长，细胞在超声作用下逐渐破碎，有助于绿色素的溶出与萃取，但是过长时间的超声处理易引起乙醇挥发及绿色素的热变性，从而导致吸光度的下降。因此，选用超声时间60 min为宜。

图5 超声时间对茶绿色素吸光度的影响

2.5 超声提取温度对茶绿色素提取的影响

由图6可知，吸光度随着超声提取温度的增加呈先上升后下降趋势，温度60 ℃时吸光度最高。这是由于随着提取温度的提升，茶细胞中纤维素酶及果胶酶的活性逐渐增大，加速纤维素及果胶的分解，有助于绿色素的分离析出，而温度过高时，纤维素酶与果胶酶由于热变性失活，影响绿色素的析出，导致提取率的降低。因此，选用提取温度60 ℃为宜。

图6 超声提取温度对茶绿色素吸光度的影响

2.6 正交试验结果

正交试验结果如表2所示，吸光度最高的因素水平组合为A2B3C4D1E2。通过极差分析可知，各因素对绿色素提取影响程度大小顺序为A＞C＞B＞E＞D，即乙醇体积分数＞超声功率＞固液比＞超声提取温度＞超声时间，理论最佳因素水平组合为A3B3C4D4E2。

表2 正交试验表

选择A3B3C4D4E2因素水平组进行验证，即选择乙醇体积分数90%，固液比1∶20（g/mL），超声功率600 W，超声时间70 min，提取温度50 ℃，在此条件下进行3次平行试验，测定其吸光度后取平均值，结果为1.010 5，高于A2B3C4D1E2组吸光度，因此最佳因素水平组为A3B3C4D4E2。

2.7 茶绿色素稳定性研究

2.7.1 温度对茶绿色素稳定性的影响

由表3可知，溶液颜色无变化，吸光度变化差异不大，说明绿色素对热稳定性良好。

表3 温度对茶绿色素稳定性的影响

2.7.2 pH对茶绿色素稳定性的影响

由表4可知，酸碱性对茶绿色素影响较大，色素颜色有显著差异。酸性、中性及弱碱性（pH≤9）条件下色素溶液基本保持黄绿色，吸光度变化不大；然而在强碱性条件下，色素溶液呈现棕色，且存在沉淀物析出。因此，茶绿色素水溶液在酸性、中性及弱碱性介质中较为稳定，在碱性条件下稳定性较差。

表4 pH对茶绿色素稳定性的影响

2.7.3 金属离子对茶绿色素稳定性的影响

由表5可知：绿色素溶液中加入Fe2+、Fe3+离子后产生增色效应，吸光度增加，且产生黑褐色沉淀；加入Al3+离子后也发生较大变化，吸光度增加且析出黄色沉淀；其他金属离子加入绿色素后无显著变化，说明茶绿色素对于Al3+、Fe2+、Fe3+稳定性较差，对于其他金属离子均具有较好的稳定性。因此，在生产或使用过程中应避免与铁质容器等发生直接接触。

表5 金属离子对茶绿色素稳定性的影响

3 结论

在单因素试验基础上，通过正交试验确定非商品枇杷茶中绿色素最佳提取工艺参数：乙醇体积分数90%、固液比1∶20（g/mL）、超声功率600 W、超声时间70 min、超声提取温度50 ℃。在此工艺下提取的绿色素热稳定性较强，在酸性、中性及弱碱性（pH≤9）环境中稳定性良好，K+、Na+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+等大部分离子对茶绿色素影响不大，但强碱性条件及Al3+、Fe2+、Fe3+金属离子对茶绿色素稳定性影响较大。枇杷茶绿色素可用于非强碱性食品的着色加工，但是在生产或者储存过程中应避免与铁质容器接触。此次试验为枇杷茶绿色素工业化生产提供技术支撑与理论依据。