基于色泽与多指标成分分析的川明参质量快速评价研究

向缅，胡平，张美，林娟，周霞，杨玉霞，周先建

（四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

0 引言

川明参（ChuanminshenviolaceumSheh et Shan）为伞形科川明参属草本植物［1］，主要分布于四川，具有和胃生津、祛痰止咳、解毒等功效，现代研究发现川明参中多糖类、香豆素类、三萜类等化学成分具有化痰镇咳、提升免疫、抗氧化等药效［2-8］。

中药材品质与有效成分、浸出物等指标密切相关［9-10］。目前，对中药材品质的判断主要依靠高精度仪器进行检测［11］，或利用传统药材评价方法“辩证论质”［12］，前者经济成本高，不利于推广；后者依赖经验判断，存在主观差异，具有一定局限性。近年已有大量文献报道利用现代色彩分析技术以及国际照明委员会（CIE）的L*、a*、b*色空间系统描述药材色泽［13-17］，发现色泽与中药材质量间存在相关性，并基于色泽建立药材品质快速鉴定体系，提高药材质量判断的准确性，但关于川明参药材色泽与品质之间的相关性及药材品质快速鉴定体系未见报道。本研究通过对川明参的色泽、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、多糖和欧前胡素质量分数的测定，分析各指标成分与色度值之间的相关性，建立快速准确鉴别川明参质量的方法，为川明参临床用药安全及可持续发展提供科学依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 样品材料

川明参药材样本共32份，来自四川省不同地区，四川省中医药科学院杨玉霞研究员鉴定为伞形科川明参属植物川明参（ChuanminshenviolaceumSheh et Shan）的干燥根，利用多功能粉碎机将其打粉，过4号筛备用，样品信息如表1所示。

表1 川明参药材样品信息

1.2 试剂

D（+）-无水葡萄糖对照品（批号：MUST-19032905）、欧前胡素对照品（批号：MUST-22112807）购自成都曼斯特生物制品有限公司；硫酸购自成都科龙化学试剂厂；苯酚、三氯乙酸、95%乙醇购自成都金山化学试剂有限公司；甲醇、乙腈购自赛默飞世尔科技公司，均为色谱纯；超纯水为实验室自制。

1.3 仪器

Agilent1290超高效液相色谱仪（Agilent公司，美国）；UV-1800紫外分光光度计（岛津公司，日本）；KQ2200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9245A电热鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；CM-5分光测色计（柯尼卡美能达中国投资有限公司）；BSA224S型电子分析天平（Sartouris股份有限公司，德国）；TDL-4A离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；BJ-150多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）。

2 方法

2.1 川明参药材粉末色泽测定

2.1.1 检测条件

参考王晓宇等［16］、吉光见稚代等［17］的方法，打开分光测色仪，先校正，取川明参样品粉末约2 g，平铺于玻璃测色皿，360～740 nm波长测量，波长间隔10 nm，测量类型为反射测量，测定口径3 mm，测定视角10°，观察光源D65（自然日光，色温度 6 504 K），测得色度值L*、a*和b*，其中，L*表示明亮度，值越大颜色越亮，值越小颜色越暗；a*表示红绿色轴，值越大颜色越偏红，值越小颜色越偏绿；b*表示黄蓝色轴，值越大颜色越偏黄，值越小颜色越偏蓝。

2.1.2 方法学考察

取川明参S4号样品粉末，按2.1.1的条件连续测量6次，色度值L*、a*、b*的相对标准差（relative standard deviation，RSD）分别为0.43%、2.91%、1.53%，表明仪器精密度良好，方法稳定可行。

2.1.3 色泽测定

按照2.1.1的条件，分别测定样品粉末的色度值L*、a*、b*值，每个样品重复测3次，取平均值，并计算ΔE*值，ΔE*表示两颜色间的色差，值越小色差越小，值越大色差越大。

2.2 川明参药材浸出物质量分数测定

2.2.1 水溶性浸出物质量分数测定

依据《中华人民共和国药典（四部）》［18］中的热浸法进行川明参水溶性浸出物测定，称取川明参粉末2 g，倒入锥形瓶中，加蒸馏水100 mL，称质量，静置1 h；接冷凝管，放入水浴锅，100 ℃微沸1 h；冷却后，再称质量，补足减失质量并混匀，过滤，取25 mL，于蒸发皿105 ℃干燥至恒重。按照式（1）计算水溶性浸出物质量分数。

式中：ω1为浸出物质量分数，%；m1为蒸发皿与浸出物总质量，g；m2为蒸发皿质量，g；m为样品质量，g。

2.2.2 醇溶性浸出物质量分数测定

参考2.2.1水溶性浸出物测定方法，将蒸馏水换成95%乙醇溶液，恒温水浴锅的温度改为80 ℃，微沸时间变为2 h。

2.3 川明参药材总多糖质量分数测定

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖对照品25 mg，蒸馏水溶解得1 mg/mL葡萄糖对照品溶液。

2.3.2 样品溶液的制备

精确称量川明参粉末0.5 g，用50 mL蒸馏水回流提取3次，每次90 min；提取液合并混匀，将其过滤，并浓缩成50 mL，取5 mL浓缩液加入1 mL 30%三氯乙酸混匀，4 ℃放置过夜，4 000 r/min离心20 min；取1 mL上清液置于50 mL容量瓶中，蒸馏水定容，得样品溶液。

2.3.3 测定条件

参考雷晓莉等［19-20］的方法，采用硫酸-苯酚法测定川明参总多糖质量分数，精密吸取2.3.1的葡萄糖对照品溶液和2.3.2的样品溶液各2 mL于10 mL试管中，各加1.5 mL 5% 苯酚试剂，混匀，加入6 mL浓H2SO4，混匀放置5 min，沸水浴20 min，立即转入冰盒冷却至室温，490 nm波长下测吸光度。

2.3.4 线性关系考察

参考雷晓莉等［18］的方法制备标准曲线，分别精密吸取0.1、0.3、0.5、1、2、2.5 mL对照品溶液于50 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，参考2.3.3条件在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为因变量，葡萄糖质量浓度（X）为自变量，得回归方程Y=45.712X+0.129 4，r=0.999 3，线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

按2.3.3的方法测定葡萄糖对照品溶液吸光度，重复6次，其吸光度值RSD=0.22%，表明精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

取川明参S4号样品溶液，按2.3.3的方法，分别于0、30、60、120、240 min测吸光度，得到RSD=0.51%，溶液显色稳定性良好。

2.3.7 重复性试验

精密称取川明参S4号样品0.5 g，共6份。按2.3.2的方法配制样品溶液，按2.3.3的方法测定，计算多糖质量分数的RSD=1.09%，表明重复性良好。

2.3.8 回收率试验

称取0.25 g川明参S4号样品粉末，加入葡萄糖标准品适量，按2.3.2的方法制备样品溶液进行检测，平均回收率为99.00%，RSD=2.84%，方法准确性良好。

2.3.9 川明参多糖质量分数测定

按2.3.2的方法制备样品溶液，依据2.3.3的条件检测多糖质量分数，并按照2.3.4所得线性回归方程Y=45.712X+0.129 4计算多糖质量分数。

2.4 川明参药材欧前胡素质量测定

2.4.1 对照品溶液制备

称取欧前胡素对照品3.43 mg，加入1 mL甲醇溶解，并稀释得857.5 μg/mL对照品溶液。

2.4.2 样品溶液制备

精确称取川明参粉末0.5 g，加入5 ml甲醇，称质量，超声（40 kHz、50 ℃）2 h，将其冷却到室温，再称质量并补足减失质量，摇匀，上清液过0.2 μm微孔滤膜，即得样品溶液。

2.4.3 色谱条件

Shim-packVelox C18色谱柱（2.7 μm，2.1×100 mm），流动相为甲醇-水（70∶30）；流速0.3 mL/min；检测波长248 nm；柱温30℃；进样量1 μL。

2.4.4 线性关系考察

配制22.500、11.250、5.625、2.813、1.406、0.703、0.352、0.176 μg/mL的对照品溶液，按2.4.3的色谱条件，分别吸取1 μL对照品溶液测定峰面积，以进样量（X）为自变量，峰面积（Y）为因变量，得回归方程为Y=28 963X-5.360 5，r=0.999 7，线性关系良好。

2.4.5 精确度试验

按2.4.3的方法吸取对照品溶液，连续进样6次，欧前胡素峰面积的RSD=1.08%，说明该仪器精确度高。

2.4.6 重复性试验

取川明参S4号样品粉末6份，按2.4.2的方法制备样品溶液，在2.4.3的条件下测定，欧前胡素质量分数的RSD=2.86%，说明该方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验

按2.4.3的方法，分别于0、2、4、8、12、24 h吸取川明参S4号样品溶液进样，欧前胡素峰面积RSD=0.16%，样品溶液在24 h内稳定。

2.4.8 加样回收率试验

精确称取6份已知欧前胡素质量分数的川明参S4号样品粉末0.25 g，每份加入质量浓度为0.29 μg/mL的欧前胡素对照品溶液5 mL，按2.4.2的方法配制样品溶液，按2.4.3的条件进样，平均加样回收率为97.16%，RSD=0.56%，表明该分析方法准确性良好。

2.4.9 样品欧前胡素质量分数测定

按2.4.2的方法配制川明参样品溶液，在2.4.3的色谱条件下检测，根据式（2）计算欧前胡素质量分数。

式中：W为欧前胡素质量分数，μg/g；A1为标准品峰面积；A2为待测样品峰面积；C1为标准品溶液质量浓度，mg/mL；V1为待测样品进样体积，mL；m3为待测样品质量，g。

2.5 结果与分析

2.5.1 川明参色泽测定结果分析

从表2可以看出，L*范围为67.86～87.40，b*范围为9.72～23.56，均为明显正值；a*范围为-0.66～4.71，大小在0左右，表明川明参药材粉末颜色大多偏黄色或乳白色，且鲜亮，与表1中肉眼观察颜色基本相符。

表2 川明参粉末色度值

2.5.2 川明参各成分质量分数

由图1和式（2）得出欧前胡素的质量分数。

图1 对照品（A）及S4号川明参样品（B）超高效液相色谱（UPLC）图

川明参的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、多糖和欧前胡素的质量分数不一致（表3、表4），可能跟产地、采收期、储存、运输、加工方式等有关。

表3 川明参浸出物质量分数%

表4 川明参多糖和欧前胡素质量分数

2.5.3 川明参色度值与各成分质量分数相关性分析

利用IBM SPSS Statistics 26.0软件对川明参色度值与各主要指标成分质量分数进行相关性分析，结果如表5所示。L*、ΔE*与醇溶性浸出物、水溶性浸出物和欧前胡素质量分数呈极显著负相关（P<0.01），与多糖质量分数呈显著负相关（P<0.05）；a*、b*与醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素质量分数呈极显著正相关（P<0.01），与多糖质量分数呈显著正相关（P<0.05）。表明L*及ΔE*的值越小，川明参各指标成分质量分数越高；a*与b*的值越大，各指标成分质量分数越高。由表5还可以看出，a*与各指标成分质量分数的相关系数较高，表明与川明参各指标成分相关性更显著，因此选择a*与各指标成分质量分数建立回归方程。

表5 川明参粉末色度值与主要成分质量分数的相关性

2.5.4 色度值a*与各指标成分质量分数建立回归方程

以川明参各主要成分质量分数（醇溶性浸出物质量分数（X1）、水溶性浸出物质量分数（X2）、欧前胡素质量分数（X3）、多糖质量分数（X4））为自变量，a*作为因变量，得到模型1；同时以川明参a*为自变量，分别以醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素及多糖质量分数作为因变量，得到模型2、3、4和5，回归分析结果如表6所示，方差分析结果如表7所示，回归系数结果如表8所示。

表6 回归分析结果

表7 方差分析结果

表8 回归系数结果

由表6可知，川明参醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素及多糖质量分数作为自变量时，a*有75.6%受这4个指标成分影响；当川明参a*为自变量时，醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素和多糖质量分数受a*影响分别为32.8%、36.5%、67.3%和13.8%。由表7可看出，模型1回归方程显著性F值为20.866，显著性Sig.为0.000 1<0.01，表明模型1回归方程极显著（P<0.01）；同样可看出，模型2、3、4回归方程极显著（P<0.01），模型4回归方程显著（P<0.05）。由表8看出，模型1回归方程式为Y（a*）=-0.104-0.201X1+0.069X2+13.353X3-0.018X4，川明参醇溶性浸出物、欧前胡素质量分数与a*的回归系数极显著（P<0.01），水溶性浸出物质量分数与a*的回归系数显著（P<0.05），多糖质量分数与a*的回归系数不显著（P>0.05）；模型2、3、4、5回归方程式分别为Y（醇溶性浸出物质量分数）=2.164+1.822X，Y（水溶性浸出物质量分数）=25.616+3.9X，Y（欧前胡素质量分数）=-0.033+0.065X，Y（多糖质量分数）=10.242+0.762X，醇溶性浸出物、水溶性浸出物及欧前胡素质量分数与a*的回归系数极显著（P<0.01），多糖质量分数与a*的回归系数显著（P<0.05）。

3 结束语

近年来针对川明参的研究多集中在其化学成分、药理药效及临床应用等方面，关于药材质量鉴定评价的研究涉及较少，药材品质优劣及药效是多个组分协同的结果，单一指标成分含量难以客观反映中药材品质，中药材综合品质如何评价已成为中医药重大科学难题。当下中药材鉴定多以外观性状观察区分为主，无客观量化指标，有一定局限性。本研究利用分光测色仪客观量化川明参药材色泽，并与多个品质指标进行相关性研究，结果显示川明参色度值与醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素及多糖质量分数均存在显著相关性，色度值对各指标成分有一定影响，一定条件下色泽偏黄且鲜亮的川明参药材的指标成分质量分数越高，药材质量越优，色泽可作为川明参药材品质评价依据之一。其中色度值a*对醇溶性浸出物、水溶性浸出物、欧前胡素和多糖质量分数的影响程度各32.8%、36.5%、67.3%和13.8%，对欧前胡素质量分数的影响最显著，可通过色度值a*初步判断川明参药材综合品质优劣，此方法简单易操作，同时可减少主观经验判断误差。另外，试验所有样品均来自四川省金堂、都江堰、巴中等道地产区，大多数药材为市场购买，针对非道地产区的药材，以及前期药材不同加工处理条件，需要进一步扩充研究，为通过色泽初步预测川明参药材品质的快速鉴别方法提供科学依据，也为后期川明参的开发利用奠定基础。