革兰氏阴性菌外膜囊泡在抗肿瘤治疗中的研究进展

李一帆，王 丹，王瑞琳，费 冰，刘 莹，任彦颖，郭梦雨，刘心伟，李永伟

（1.河南中医药大学，郑州 450046；2.河南中医药大学第二附属医院，郑州 450002）

据2019 年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计，癌症目前是全球主要死亡原因之一，造成了巨大的经济负担，也是阻碍人类期望寿命延长的重要因素[1]。传统的肿瘤治疗方法如手术切除易受到肿瘤部位或肿瘤转移的限制，而化疗的主要缺点是药物吸收到正常或肿瘤组织中的不良反应以及抗肿瘤药物耐药性的出现。因此，以分子靶向治疗和免疫治疗为代表的精准治疗逐渐成为肿瘤治疗的重点。

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由革兰氏阴性菌释放的直径约为20～250nm 的脂质双层囊泡状结构，含有多种亲本菌的成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和各种病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），如LPS，脂蛋白、肽聚糖、DNA 和RNA 等[2]。OMVs 含有的细菌抗原和各种PAMPs 可被宿主模式识别受体识别，从而增强细胞因子和共刺激分子的表达，促进抗原呈递，有效激活宿主免疫系统，达到肿瘤免疫治疗效果。此外，OMVs 的纳米中空结构有利于进行工程设计，使其作为抗肿瘤药物的递送载体，实现肿瘤靶向治疗和化疗-光疗的结合。鉴于OMVs 在细菌疫苗、佐剂、肿瘤免疫治疗剂、药物递送载体中的开发和应用，其被认为是抗肿瘤治疗的新型手段，具有良好的应用前景[3-5]。因此本文综述OMVs 的结构组分、提取方式、产生机制以及在抗肿瘤治疗中的研究进展，为将来OMVs 的深入研究和临床抗肿瘤应用提供参考。

1 外膜囊泡概述

1.1 外膜囊泡的结构组成 OMVs 是由革兰氏阴性（G-）菌分泌的直径约为20～250nm 的球形囊泡状结构，其由内膜（inner membrane，IM）和外膜（outer membrane，OM) 双层膜组成，中间是肽聚糖层（peptidoglycan，PG）和周质空间（periplasmic space），外膜和肽聚糖层通过膜锚定蛋白（如Lpp,OmpA 和Tol-Pal 复合物）连接。OMVs 起源于细菌外膜，含有大量细菌外膜成分，如磷脂（phospholipid，PL），LPS，OMPs 以及一些来自IM 和OM 之间的周质成分，它们在释放过程中被包裹在囊泡腔中[6]。OMVs 包含多种PAMPs，能够与宿主模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）结合，从而激活宿主免疫系统，促进细胞因子分泌和细胞焦亡[7]。此外，OMVs 还可携带大量来自细菌的毒素、黏附素等，通过与宿主细胞相互作用，对癌细胞发挥细胞毒性作用，具有内在的抗肿瘤活性[8]。由于OMVs 独特的中空结构和组成成分，其在革兰氏阴性菌的感染、微生物-宿主间相互作用及其作为抗菌和抗肿瘤药物递送的载体等方面发挥着至关重要的功能。

1.2 外膜囊泡的形成机制 致病性和非致病性G-菌都会产生OMVs。目前关于OMVs 生物发生的研究成果提出了几种主要的OMVs 模型。其中外膜曲率增加是被研究报道最多的一种G-菌OMVs 形成的机制。在细菌周质空间中，错误折叠的蛋白质或包膜成分（脂多糖和肽聚糖片段）的局部积累会对细菌外膜产生压力，导致外膜膨胀，曲率增加并最终以OMVs 这种小泡的形式释放出来[9]。还有研究发现，铜绿假单胞菌喹诺酮信号分子（Pseudomonas quinolonesignal,PQS），可插入外膜的外小叶来诱导其曲率增加，促进OMVs 形成[10]。

第二种机制是脂蛋白和肽聚糖交联率降低。在大肠埃希菌中，与PG 共价交联的脂蛋白（lipoprotein，Lpp）是一种维持细菌包膜结构完整性的脂蛋白。有研究对Lpp-PG 交联作用相关的基因进行敲除，发现PG 结构和代谢的调节可以通过交联Lpp 的水平上下调节OMVs 的产生[11]。OmpA 是另一种外膜脂蛋白，与肽聚糖层非共价结合。MARCHANT等[12]的研究也表明缺乏OmpA 的伤寒沙门菌突变体表现出OMVs 的产生增加。

磷脂的积累也会增加OMVs 的产生。最新的研究发现，VacJ/Yrb 基因沉默或删除时会增加OM 外层小叶中的磷脂数量，导致富含磷脂的OMVs 从外膜表面分离[13]。此外，噬菌体介导的爆炸性细胞裂解和抗生素等也会促使OMVs 产生增加[14-15]。

1.3 外膜囊泡的分离鉴定 OMVs 从细菌细胞表面自然分泌，因此位于细菌培养物的无细胞上清液中。目前OMVs 的提取有多种方法，其中超速离心和密度梯度离心是分离和纯化OMVs 最常用的方法，被称为OMVs 分离的“金标准”[16]。超速离心和密度梯度离心的主要原理是根据培养上清液中不同颗粒的大小和密度设置不同的离心力，并利用平衡沉降原理完成OMVs 的纯化。

当前，对于OMVs 鉴定的三大主流方法分别是从OMVs 的形态、大小以及组分进行表征。透射电子显微镜（TEM）观察OMVs 形态的方法被认为是鉴定OMVs 的“金标准”。纳米颗粒跟踪分析（NTA）被用来测量OMVs 的粒径大小。关于OMVs 的组分，脂质可使用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）进行鉴定，蛋白质组分通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析OMVs 的蛋白质谱[17]。

2 OMVs 在抗肿瘤治疗中的应用

OMVs 是源自革兰氏阴性菌的天然生物纳米材料，由于其纳米级球形囊泡结构，具有轻易穿过血管、淋巴管和组织的优势。OMVs 还含有细菌抗原和病原体相关分子模式（PAMPs），可以很容易地与免疫细胞相互作用或被免疫细胞摄取，被作为潜在的肿瘤治疗的免疫佐剂或肿瘤靶向治疗的药物载体。重要的是，OMVs 可以通过细菌的基因工程进行功能修饰，从而为作为肿瘤纳米疫苗递送平台的应用奠定了基础。

2.1 肿瘤靶向治疗

2.1.1 OMVs 是纳米级脂质双层囊泡结构：OMVs是细菌在生长过程中连续释放的20～250nm 的脂质双层囊泡状结构，其纳米级的大小有助于它们通过淋巴引流或被吞噬的途径被抗原呈递细胞（antigen-presenting cells,APCs）携带进入淋巴结，通过激活免疫系统达到治疗肿瘤的作用[18]。此外，OMVs 作为纳米颗粒还具有高渗透长滞留效应（EPR），与正常组织相比，其更容易渗透进入肿瘤组织并保持在肿瘤中积聚的能力，以诱导局部免疫。如源自大肠埃希菌的OMVs 在小鼠黑色素瘤的治疗中，可以广泛渗透进入角质层和真皮层，通过透皮治疗的方式直接将外部治疗分子递送到黑色素瘤部位[19]。OMVs 作为透皮和肿瘤靶向药物递送的纳米平台，具有高效率和生物安全性，在浅表肿瘤的治疗中具有巨大潜力。

2.1.2 OMVs 作为抗肿瘤药物靶向递送的载体：为了避免肿瘤免疫治疗过程中的免疫抑制状态，需要联合药物治疗来进一步增强OMVs 的肿瘤免疫治疗潜力，从而彻底根除肿瘤并防止肿瘤复发和转移。OMVs 在复杂的革兰氏阴性细胞包膜上递送生物大分子的独特能力，为其作为药物递送载体提供了较大的优势。KUERBAN 等[20]的研究证明了来自减毒肺炎克雷伯菌的OMVs 作为一种生物药物递送载体，已成功用于将抗肿瘤药物阿霉素（DOX）转运到非小细胞肺癌细胞系中，并抑制小鼠模型中的肿瘤生长。该研究还提出OMVs 可以募集TME 巨噬细胞，触发适当的免疫反应，从而增强DOX 的抗肿瘤作用，且未观察到明显的毒性。另外还有研究将紫杉醇（PTX）、小干扰RNA 等通过巨噬细胞摄取或电穿孔的方法加载到OMVs 中，以到达肿瘤部位发挥抗肿瘤作用[21]。最新的一项关于OMVs抗肿瘤治疗的研究还联合光动力疗法/化疗/免疫疗法来治疗三阴性乳腺肿瘤，发现这种治疗策略在根除肿瘤上具有很强的功效，还能有效地防止肿瘤向肺部的转移[22]。

2.2 肿瘤免疫治疗 OMVs 可激活宿主免疫系统，攻击和清除肿瘤细胞。细菌抗原和多种PAMPs 的共存使OMVs 作为免疫刺激剂具有巨大的潜力。其在细胞外和细胞内可被宿主模式识别受体（PRR）所识别，从而激活宿主免疫系统，刺激抗原呈递细胞，并导致T 细胞成熟，进而对OMVs 产生强大的体液和细胞免疫应答[23]。OMVs 还携带来自亲本菌的LPS，黏附素和毒力因子。这些物质可通过分泌抗肿瘤免疫反应的细胞因子如干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α 等，进而引起肿瘤损伤[24-25]。OMVs通过干扰素-γ 介导的抗肿瘤反应不仅能清除肿瘤，而且其抗肿瘤反应具有长期记忆作用，可减少肿瘤的复发[25]。还有研究表明来自鼠伤寒沙门氏菌的OMVs 可通过激活宿主免疫系统和逆转免疫抑制肿瘤微环境来促进肿瘤消退[26]。其中注射OMVs 的小鼠肿瘤细胞不仅受到NK 细胞的杀伤而且发生了细胞自噬和凋亡。由此可见，细菌OMVs 作为新型肿瘤免疫治疗剂具有巨大潜力，可以触发对各种癌症的有效抗肿瘤反应，而不会产生显著的不良反应。

2.3 肿瘤疫苗 OMVs 是脂质纳米囊泡结构，含有多种蛋白和特异性抗原，由于其免疫调节和向宿主细胞呈递多种异源抗原的能力，OMVs 可以设计为一种有效的肿瘤治疗性疫苗，通过基因工程将肿瘤抗原或小分子药物递送到APCs 甚至靶向癌细胞，因此在疫苗开发中具有巨大潜力。相比被动免疫治疗，肿瘤疫苗的优势在于T 细胞驱动的反应和相关记忆可能在疾病复发期间提供帮助。

基因工程领域的进步促使OMVs 作为肿瘤疫苗平台的进一步改进，从而提高产量，降低LPS 和磷壁酸对OMVs 的毒性，并用同源和异源抗原进行修饰，以增强免疫原性并提供更广泛的保护。OMVs 经基因和化学修饰将被赋予更多的功能。为了解决自然释放OMVs 的低产量和脂多糖可能带来的毒性作用，有研究人员开发了一种膜抗原的通用模块（GMMA），即工程化的OMVs[27]，以增强自然OMVs 的形成、降低反应性和毒性及过表达免疫原性抗原。ROSSI 等[28]的研究通过敲除酰基转移酶基因msbB 或htrB 来修饰LPS 的内毒性部分脂质A，从而降低其反应原性。据报道，通过基因工程方法将肿瘤抗原人瘤病毒16 型早期蛋白E7（HPV16E7）呈递在大肠埃希菌衍生的OMVs 上，获得重组的OMVs 疫苗。将该疫苗接种在移植TC-1 宫颈癌细胞的小鼠可显著抑制肿瘤的生长[29]。还有研究人员通过基因工程技术改进了OMVs 的递送能力，使用纳米膜过滤器通过连续挤出制备表面表达肿瘤靶向的细菌原生质体纳米囊泡，为实体肿瘤部位提供受体介导的被动靶向。加载化疗药物的原生质体纳米囊泡显示出剂量依赖性细胞毒性和肿瘤组织靶向特异性，并有效预防肿瘤异种移植小鼠的肿瘤生长[30]。基因工程OMVs 在抗肿瘤作用中的巨大贡献，为其作为有效和安全的抗肿瘤疫苗提供了巨大的潜力，以优化和促进肿瘤治疗的发展。

3 未来与展望

近年来肿瘤发病率的激增促使研究人员致力于开发新型抗肿瘤药物和手段。尽管大量的研究发现了OMVs 作为佐剂、肿瘤治疗剂和药物递送载体以及工程细菌OMVs 作为肿瘤疫苗平台的巨大潜力。在OMVs 的抗肿瘤治疗中，提高OMVs 的安全性并保持佐剂效力以及使用OMVs 进行个性化治疗仍需要进一步改进。此外，肿瘤的异质性可能需要开发出具有普遍抗肿瘤效应类型的OMVs。当前，OMVs 作为肿瘤治疗剂或进行肿瘤疫苗开发还在实验室研究阶段，在广泛临床应用之前，仍有许多问题需要解决。