帕金森病患者血清miR-7和α-Syn表达水平与认知功能障碍的相关性研究

白 雪，董巧云，赵 丽，姚 彦，王 博（沧州市中心医院神经内五科，河北沧州 061000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种神经系统变性疾病，全球发病率0.3%左右[1]，临床主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等症状。PD 发病原因是中脑内黑质多巴胺能神经元变性或死亡伴路易体（lewy bodies，LB）出现，从而阻碍黑质纹状体通路[2]，而LB 主要成分是α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）。

α-Syn 是一种主要存在于突触前末端的酸性蛋白，其单体在游离状态下是未折叠结构，与生物膜结合时变为α-螺旋结构，当其表达增强或变异时，可转变为纤维样的β-折叠结构，形成寡聚体和多聚体[3]。大量研究发现PD 患者脑组织中存在大量失调的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），其通过结合目标mRNA 的3’-非翻译区，导致靶mRNA不稳定或被切割从而干扰翻译，是细胞增殖分化重要转录后调节因子。有研究表明miR-7 在PD 患者黑质多巴胺能神经元中广泛表达[4]，与PD 的发生、发展亦有密切联系。随着对PD 研究的不断进展和深入，越来越多的学者发现除了其经典的运动症状外，认知功能等非运动症状也为其重要的临床表现。

认知障碍在早期PD 患者中较为常见，本研究通过检测PD 患者血清中miR-7 和α-Syn 表达水平，探究两者与PD 患者认知功能障碍的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020 年1 月～2022 年1 月沧州市中心医院收治的PD 患者106 例作为PD 组，其中男性45 例，女性61 例，年龄64.75±3.46 岁；文化程度：初中及以下18 例，高中及以上88 例。本组患者均符合中国帕金森病治疗指南(第三版)[5]相关标准。Hoehn-Yahr 分级：1 级12 例，2 级20 例，2.5 级24 例，3 级10 例，4 级30 例，5 级10 例。随机选择同期性别、年龄相匹配的106 例健康体检者作为对照组，其中男性50 例，女性56 例，年龄65.20±4.47 岁；文化程度：初中及以下24 例，高中及以上82 例。两组受试者年龄、性别及文化程度差异无统计学意义（χ2/t=0.477，0.820，1.069，P=0.490，0.413，0.301）。PD 组纳入标准：①本研究所有PD 患者均符合相关诊断标准，均伴有运动迟缓、姿势步态障碍、静止性震颤等症状；②依从性好；③未进行过抗抑郁或抗精神病治疗。对照组纳入标准：①本组受试者经体检正常者，无PD家族史；②生活习惯以及饮食结构与PD 组患者相似。排除标准：①并发颅内器质性疾病者；②由内科疾病或药物导致的认知功能障碍者；③并发有慢性炎性反应或各种感染者；④继发性帕金森综合征；⑤无法配合研究者；⑥严重肝、肾、心功能不全者。本研究经本院伦理委员会批准，且所有受试者或其家属均签署参加本研究的知情同意书。

1.2 仪器与试剂 紫外分光光度计（型号：N4S/N4，杭州诺丁科学器械公司），酶标仪（型号：F50，江苏博美达生命科学公司），Trizol 试剂（货号：GMS12279，上海杰美基因医疗公司），miRNA 反转录试剂盒（货号：K1622，武汉科昊佳生物科技公司），人α-Syn 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：F00000，上海西唐生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 血清获取：于PD 组患者入院第二天早晨及对照组健康体检时采集肘静脉血5 ml，而后放于冷冻离心机内以3 000 r/min 离心10 min，再将上层血清样本移至新的离心管中，放-80℃冰箱冷冻备用。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清miR-7 水平：将预冷的PBS 加入血清中洗涤两次，再把洗涤过的血清倒进研钵中加入Trizol 试剂，以提取总RNA，提取过后用紫外分光光度计检测RNA 的纯度。选择吸光值在1.8～2.1 的血清样品，用miRNA 反转录试剂盒对所得RNA 进行反转录，获得cDNA。取cDNA模板2μl，加入通用后端引物1μl，miR-7 特异前端引物1μl，2×SYBR GREEN Master Mix 1 μl，再加入无菌蒸馏水至20 ml。反应条件设置为95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30s，40 个循环。用2-ΔΔCt法计算miR-7 表达量。

1.3.3 ELISA 法检测血清α-Syn 水平：采用双抗夹心ELISA 法检测α-Syn 水平，严格按照人α-Syn ELISA 试剂盒说明进行操作。

1.3.4 认知功能评估：采用简易精神状态量表（mini-mental state examination，MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）对PD 患者的认知功能进行评估。其中MMSE 评分＜27 分存在认知功能障碍，27～30分认知功能正常；而MoCA 评分＜26 分存在认知功能障碍，26～30 分认知功能正常。均由神经内科专科医生按国内标准完成测评，分数越低认知功能越差。

1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 22.0 分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q法检验，计数资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman 法分析血清miR-7，α-Syn 水平与MMSE 评分、MoCA 评分的相关性；采用Pearson法分析PD 患者血清miR-7 与α-Syn 水平的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象血清miR-7 和α-Syn 水平比较 PD组血清miR-7 水平明显低于对照组（6.95±1.74 vs 8.21±1.35），血清α-Syn水平明显高于对照组（6.28±1.05μg/L vs 3.52±0.56μg/L），差异具有统计学意义（t=5.890，23.879，均P=0.000）。

2.2 不同Hoehn-Yahr 分级患者血清miR-7 和α-Syn水平比较 PD 患者Hoehn-Yahr 1 级、2 级、2.5 级、3 级、4 级和5 级血清miR-7（8.03±0.99，7.65±0.76，7.12±1.06，6.64±0.65，6.31±0.73，5.93±0.82） 水平逐渐降低，α-Syn（3.79±0.39，4.29±0.81，5.48±1.07，6.37±0.82，7.55±1.34，9.01±0.76 μg/L）水平逐渐升高，差异具有统计学意义（F=13.201，55.330，均P＜0.05）。2.5 级、3 级、4 级、5 级PD 患者血清miR-7，α-Syn 水平均低于1 级患者（q=4.263～16.923,均P＜0.05）；3 级、4 级、5 级PD 患者血清miR-7 水平均低于2 级患者，2.5 级、3 级、4 级、5 级血清α-Syn 水平均高于2 级患者（q=4.319～16.917，均P＜0.05）；4 级、5 级PD患者血清miR-7，α-Syn 水平均高于2.5 级患者（q=4.899～13.019，均P＜0.05）；4 级、5 级PD患者血清α-Syn 水平均高于3 级患者（q=4.486，18.194，均P＜0.05），且5 级PD 患者血清α-Syn水平高于4 级患者（q=5.550，均P＜0.05），差异具有统计学意义。

2.3 PD 患者血清miR-7，α-Syn 水平与MMSE 评分、MoCA 评分的相关性及血清miR-7 与α-Syn水平的相关性 Spearman 法分析显示，PD 患者血清miR-7 水平和MMSE 评分呈正相关（r=0.574，P=0.000），血清α-Syn 水平和MMSE 评分呈负相关（r=-0.550，P=0.000）。Spearman 法分析显示，PD 患者血清miR-7 水平和MoCA 评分呈正相关（r=0.597，P=0.000），血清α-Syn 水平和MoCA评分呈负相关（r=-0.537，P=0.000）。Pearson 法分析显示，PD 患者血清miR-7 与α-Syn 水平呈负相关（r=-0.608，P=0.000）。

3 讨论

PD 是由于脑内黑质多巴胺能神经元病变伴随路易小体（lewy body，LB）出现，导致神经系统变性的疾病，在中老年人群中较常见。中国55 岁以上人群患PD 概率大约是1.7%，且随着老龄化加剧，PD 患病率呈上升趋势[6]。医学界普遍认为PD发病和LB 有关，是通过polo 样激酶2 促进α-Syn第129 位丝氨酸磷酸化[7]，被磷酸化的α-Syn 形成寡聚体，组成中脑内的LB，LB 阻碍黑质纹状体通路导致发病[8]。α-Syn 形成的寡聚体和多聚体具有细胞毒性[3]，可通过多种途径致黑质多巴胺能神经元损伤；可通过Toll 样受体4 使受体神经元周围的胶质细胞活化[9]，进而促进一氧化氮和过氧化物等有毒物质释放至胞外，加重黑质多巴胺能神经元损伤；α-Syn 聚集物通过结合Tau 蛋白，降低微管蛋白合成，使细胞骨架发生改变，进而导致神经元损伤[10]；α-Syn 寡聚体也可通过形成细胞膜上跨膜小孔，使完整细胞膜发生破坏，从而发挥其毒性作用。也有研究认为，α-Syn 磷酸化后能产生更多寡聚体和不溶性成分[11]，使泛素-蛋白酶系统降解发生障碍，导致胞浆内LB 形成及黑质多巴胺神经元凋亡，引发PD。杨清等[12]研究发现，PD 患者血清α-Syn水平显著高于对照组，且随着病情加重不断升高[13]。本研究结果与杨清等[12]研究结果基本一致，可能是由于PD 是一种蛋白降解障碍性疾病，而α-Syn是存在神经元细胞的突触前蛋白，其与神经元发育、形成以及突触功能密切相关，但是突变的α-Syn过度聚集将会造成泛素-蛋白酶系统降解障碍，产生毒性，从而导致细胞内蛋白降解障碍、聚集，最终造成PD 的发生。另外本研究结果还显示，随着Hoehn-Yahr 分级的增加，血清α-Syn 水平逐渐升高，且PD 患者血清α-Syn 水平与MMSE 评分、MoCA 评分均呈现负相关，此结果说明随着PD 患者疾病严重程度增加，血清α-Syn 水平也呈现增高的趋势，而α-Syn 的聚集将会损伤多巴胺能神经元，从而导致患者认知功能障碍的发生。

大量研究发现PD 患者或动物模型脑组织中存在大量失调的miRNA，miRNA 参与PD 发病的各个过程，是一种很好的诊断标志物，具有较高敏感度和特异度[14-15]。王一帆等[16]研究表明，miR-7 可在百草枯诱导多巴胺能神经元损伤中抑制α-Syn蛋白表达，从而发挥神经元保护作用。TITZE-DEALMEIDA 等[17]研究表明，PD 患者多巴胺能神经变性相关的大脑区域中miR-7 水平明显降低。黑质中miR-7 的消耗和α-Syn 的积累，与多巴胺能细胞的丢失以及纹状体中多巴胺的减少有关。CHOI等[18]研究表明miR-7 可通过调控α-Syn mRNA的3’-非翻译区抑制α-Syn 的蛋白水平。本研究结果表明，PD 患者血清miR-7 水平下降，且随着病情加重而逐渐降低，与上述结果相似。推测可能是由于miR-7 诱导的α-Syn 下调可保护细胞免受氧化应激，miR-7 起到调节α-Syn 和多巴胺的作用。本研究结果还显示，PD 患者血清miR-7 水平和MMSE 评分、MoCA 评分均呈正相关，提示血清miR-7 水平变化与PD 患者认知功能有关，血清miR-7 水平降低可能通过影响MMSE 评分、MoCA评分而参与认知功能障碍的发生。另外，Pearson 法分析显示，PD 患者血清α-Syn 水平与miR-7 水平呈负相关，因此认为miR-7 和α-Syn 可能共同通过影响PD 的发展进程从而影响PD 患者认知功能障碍。

综上所述，随着PD 患者病情加重，血清miR-7 水平逐渐降低，α-Syn 水平逐渐升高，二者均与认知功能评分具有显著相关性，推测miR-7 在调节α-Syn 和多巴胺的生理中具有重要作用，并可能为研究PD 的病理学提供新的范例。但是由于本研究纳入样本量相对较少，未通过分子学角度及基础实验进行分析其内在的作用机制，导致本研究存在诸多不足之处，还有待更深入研究。