类器官在生物医学中研究进展及应用

孙广晨, 李宏宇, 陈 江, 王煜晔, 高 聪, 刘小毓, 常旭东, 韩 杰, 王诗雨, 高 飞

1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地,辽宁 沈阳 110016;2.北部战区总医院 消化内科,辽宁 沈阳 110016;3.大连医科大学,辽宁 大连 116000;4.中国医科大学,辽宁 沈阳 110000

在生物医学领域,动物模型和二维细胞系模型常被应用于探索发育和疾病机制、评价药物效果及毒性、了解细胞信号通路等方面,但这两种模型均具有局限性。动物和人类之间的物种差异决定了动物模型可用性有限。而二维细胞系模型因缺乏结构和维度,无法完全模拟出细胞与细胞之间或细胞与基质之间的相互作用,这导致其无法充分揭示组织中细胞的功能和细胞间的信号交流［1］。相比于上述两种模型,三维培养的类器官不仅能够高度模拟来源组织的结构和功能,且可在体外增殖过程中始终保持基因组的稳定性。因此,类器官技术已被广泛应用于建立生物样本库,进行高通量筛选,研究发育和疾病机制,指导临床个性化用药等诸多方面。本文就类器官在生物医学中的研究进展及应用作一综述。

1 类器官的发展历程

类器官一词最早于1946年在一项病例报告中作为畸胎瘤的同义词出现［2］。受限于当时的技术水平,类器官的实现仅有理论可能,直到20世纪80年代, Bissell和Peterson发明了三维细胞培养技术［3］,类器官技术具有了可行性。2009年,Sato等［4］利用小鼠富含亮氨酸的重复G蛋白偶联受体5阳性(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5-positive,LGR5+)干细胞,在体外培养出无间充质微环境的小肠隐窝-绒毛结构,该类器官模型重现了隐窝样区域和绒毛样上皮区域的三维结构。2011年,Sato等［5］构建了人肠道类器官及结直肠癌类器官,肿瘤类器官被成功建立。

随着类器官技术逐渐发展为独立的研究领域。2014年,Lancaster等［6］对类器官这一概念进行了系统、精确的定义,即从干细胞或器官祖细胞发育而来的器官特异性细胞类型的集合,并能够以与体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建。类器官研究不断深化,多种类器官不断被成功构建,包括但不限于脑、肝、肺、肾、胃、垂体、内耳、食管、气道、胰腺、乳腺、膀胱、卵巢、结肠、视网膜、甲状腺、心血管、输卵管及子宫内膜等类器官,其中,不仅包括正常器官组织的类器官,还包括其肿瘤组织的类器官,以及相应的类器官芯片体系。2021年,类器官技术被列为中国“十四五”重点研发计划重点专项。2022年,美国食品药品监督管理局批准了基于类器官芯片技术获得临床前数据的新药(NCT04658472),开始进入临床试验阶段。

2 类器官的构建

培养类器官的干细胞来源分为多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)和成体干细胞,其中,PSCs包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)。此外,患者来源的类器官(patient-derived organoids,PDOs)因通常用于肿瘤患者的建模和药物筛选,也被称为肿瘤类器官。

获取培养类器官组织样本的方式包括手术切除、穿刺活检、液体样本等［7］。初步处理组织样本后(切除非上皮组织),通过机械解离和(或)消化解离(如胶原酶、胰酶、DNA酶和解离酶等)使其产生单细胞或小细胞团,再将其铺在3D细胞外基质中,最后添加包含多种生长因子的培养基进行培养。常用的基质胶有Matrigel、Geltrex和Cultrex等,其为分离自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤的可溶性基底膜提取物,主要成分包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白,基质胶的作用是为干细胞提供具有支架功能的三维环境,并允许细胞在支架上聚集、增殖及迁移［8］。

生长因子的选择会因培养的组织类型不同进行调整,如在培养人小肠类器官需加入胃泌素、烟酰胺、转化生长因子-β抑制剂和p38抑制剂［5］。培养肿瘤类器官时,为了减少克隆选择,避免混淆药效,往往选用减少生长因子的培养基［9］。但培养基一般包含以下4类生长因子:促进干细胞生长、增殖及分化的Wnt信号通路激活剂,如Wnt-3a［10］、R-spondins［11］;促进干细胞扩增的转化生长因子-β/骨形态发生蛋白信号通路抑制剂,如Noggin［12］;促进上皮细胞增殖的酪氨酸受体激酶配体,如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)［13］;抑制干细胞凋亡的ROCK抑制剂,如Y-27632［14］。类器官的培养方法多样,除了通过基质胶细胞支架方法培养,Capeling及Neal等［15-16］分别使用悬浮培养法和气液界面法培养出了肠道类器官。此外,PDOs的培养方法还包括微流控培养法、旋转生物反应器法等［17］。

3 类器官的应用

3.1 发育模型 既往研究多使用小鼠等动物模型分析人类大脑的发育和功能,但人类大脑与小鼠大脑间存在较大差异,而人脑类器官的发育过程与人类胎儿脑相似,为研究供新的思路［18］。Fleck等［19］利用人脑类器官绘制出人类大脑发育图谱,使用CRISPR-Cas9技术确定了对大脑不同区域的神经元发育具有重大影响的基因开关。Revah等［20］成功将人皮层类器官移植到大鼠大脑中,以此探究大脑的连接性和功能性。此外,心脏、肺、肝、肾、肠道、骨、输卵管和子宫内膜等诸多类器官也已经用于人体发育、功能、代谢及组织间相互作用的机制研究中。

3.2 疾病模型 类器官在功能和结构上与人体真实器官高度相似,因此,能够用来建立疾病模型,探究疾病的发生与进展机制,开发新的治疗策略。法布里病是一种由半乳糖苷酶α基因突变引起的X连锁溶酶体贮积病,由于缺少人体实验模型,该病的研究和治疗受到了限制。Kim等［21］使用hiPSCs衍生的肾类器官和CRISPR-Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)基因编辑技术成功对法布里病建模,揭示了法布里病与球状神经酰胺(Gb3)和谷胱甘肽之间的关系。Papes等［22］借助人脑类器官揭示了病理性转录因子4(transcription factor 4,TCF4)突变如何影响人类神经组织,即TCF4功能丧失导致Wnt信号转导减少,SOX基因表达降低,最终导致体外祖细胞增殖减少,这意味着利用基因治疗工具恢复该基因功能有望治疗皮特-霍普金斯综合征。类器官已经成为许多疾病治疗和机制研究不可或缺的工具,包括先天性心脏病［23］、炎症性肠病［24］、肝损伤［25］、唐氏综合征［26］、阿尔兹海默病［27］、帕金森病［28］、2型糖尿病［29］、常染色体隐性多囊肾病［30］等诸多疾病。值得注意的是,类器官模型还能够模拟病毒或细菌感染的过程,在研究幽门螺旋杆菌［31-32］、寨卡病毒［33-36］、诺如病毒［37］、轮状病毒［38］、严重急性呼吸综合征冠状病毒2［39］、人乳头瘤病毒［40］等病毒的感染和肠道菌群及其代谢产物［41-43］对人体的影响中是具有重要价值的3D模型。

3.3 药物筛选 与传统的动物模型和2D细胞模型不同,3D培养的类器官模型能够准确地模拟出器官的三维结构,在异质性和遗传特征上与原始组织保持高度一致,不仅能实现单次超过5 000种药物的筛选,还能够兼顾个体对药物的敏感程度［44］,其高效性和精准性在药物筛选方面显示出了巨大的潜力,极大地节省了新药研发的时间和成本。Gupta等［45］通过靶向药物筛选,确定其能够维持FANCD2和RAD51的活性,发现延缓顺铂诱导下肾类器官损伤模型慢性肾病进展的药物SCR7(一种DNA连接酶IV抑制剂)。Herpers等［46］对结直肠癌PDOs生物库和配对的健康结肠黏膜样本进行大规模双靶点抗体(bispecific antibodies,bAbs)功能筛选,发现了MCLA-158,这种bAb能够特异性触发LGR5+肿瘤干细胞中的EGF受体降解,对健康LGR5+结肠干细胞的毒性最小。

类器官还能够高度复刻临床患者的药物反应［47］,用来评价药物的效果和毒性。Zhang等［48］通过肝类器官观察到与药物性肝损伤患者临床表现相关的泰诺福韦-伊那吉韦相关肝毒性。疾病和药物的影响往往涉及多个器官。Rajan等［49］建立了一个包括脑、心脏、肺、肝、内皮和睾丸6种类器官的集成系统,相比于孤立环境下的单一类器官模型,该系统能够复刻器官之间的相互作用,综合模拟药物在体内的代谢和毒性情况。

3.4 基因工程 能够稳定传代培养的类器官为基因编辑提供了平台,使基于体外3D模型的基因修复成为可能。此外,类器官技术联合基因编辑技术还有助于建立既往无法在体外重现的疾病模型［50］,且该模型可以用于药物的效果评价和筛选。囊性纤维化是由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变所致,此疾病曾经无法治愈且具有致命性［51］。2013年,Schwank等［52］使用CRISPR/Cas9基因编辑技术通过同源重组纠正了囊性纤维化患者来源肠道干细胞类器官的CFTR基因位点。

3.5 肿瘤 肿瘤患者的肿瘤表型在治疗过程中不断变化,这种异质性导致了肿瘤原发和获得性的耐药性,治疗失败及病程的进展和恶化,成为针对广泛患者人群临床试验的一大障碍［53-54］。既往人源肿瘤细胞系移植(cell-derived xenograft,CDX)模型和人源肿瘤组织异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型常用于肿瘤研究,但CDX模型在体外培养过程中不断适应环境及被环境所选择,无法准确概括肿瘤的异质性［55］;PDX模型则面临着成本高昂、移植率低和伦理等问题［56］。而肿瘤类器官模型能够在体外稳定保存母体肿瘤的遗传特征、药理学特征、形态特征、组织学特征及分子特征［57］,作为疾病模型,可以应用于开发药物、指导个体化用药、研究肿瘤的发生及发展机制。

肿瘤类器官可用于寻找生物标志物及潜在的治疗靶点,并针对该靶点开发新型抗肿瘤药物［58］。Kryeziu等［59］研究发现,在33种在研抗肿瘤药物中,相比于初始性直肠癌肝转移PDOs,复发性直肠癌肝转移PDOs对第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂模拟物LCL161的体外敏感性最强,并通过功能分析和基因表达进一步解释了产生该结果的可能原因。因此,作为一种可能的实验性疗法,LCL161或可被用于治疗肝切除术后或标准系统治疗后复发的转移性直肠癌。

临床常用的抗肿瘤药物包括细胞毒药物(如环磷酰胺、甲氨蝶呤、顺铂等)、靶向药物(如靶向EGFR、HER2、MET等靶点的药物)、免疫治疗药物(PD-1抗体、PD-L1抗体)等。实际应用中,往往采取多手段联合治疗,基于肿瘤类器官的药物敏感性检测可以指导患者选择个性化药物,提高临床疗效,减少不良反应。Wang等［60］针对化疗和靶向治疗进行了基于肺癌类器官的药物敏感性测试(lung cancer organoids-based drug sensitivity tests,LCO-DSTs),研究表明,药物敏感性与临床反应的总体一致性可达83.33%,提示LCO-DSTs在精准医学指导用药中具有巨大潜力。

Buti等［61］通过对胃类器官的培养,揭示了细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)的致癌机制,在幽门螺旋杆菌感染期间肿瘤抑制因子ASPP2被CagA破坏细胞极性,若能干扰CagA-ASPP2的相互作用,则可以防止细胞极性的丧失,并减少细菌在体内的定植。Yao等［62］从接受了新辅助化疗的局部晚期直肠癌患者中建立了一个活体类器官生物库,经临床试验数据证实,直肠癌类器官真实地再现了直肠癌的病理生理学和遗传变化。

3.6 再生医学 作为供体器官,类器官不仅安全、稳定、可塑,并且获取方便。值得注意的是,其安全性不仅体现在移植部位精准,且多数类器官移植手术以微创形式操作,还体现在来源于自体细胞的类器官能够使免疫排斥风险最小化［63］。Watanabe等［64］详细描述了如何将肠道类器官移植到葡聚糖硫酸钠盐诱导的结肠炎小鼠模型中,为肠道类器官移植治疗难治性溃疡性结肠炎提供了坚实的理论基础。目前,除肠道类器官之外,肝、肾、胆管、胰腺、泪腺、唾液腺等类器官的移植也得到了不同程度的应用。

4 总结

类器官的设计在不断完善［65］,但作为仍在发展中的前沿技术,类器官仍有一些亟待解决的问题。类器官在应用和培养方面需要标准化,例如目前常用的基质胶之间往往存在批次间的差异,不同研究团队的类器官培养方法也不尽相同,进而影响实验的准确性和可重复性。此外,应当制定具有统一标准的类器官培养方案,并保障质量、满足大规模生产需求［63］。除技术问题,类器官衍生出的伦理问题也需要重视,如关于长期储存和使用类器官所需的捐赠者授权和伦理审查类型。因此,确立类器官的道德和法律地位需要进行伦理讨论和实证研究,尤其是人脑类器官［66］。

类器官技术的发展趋势是进一步突破单一技术的局限,与实时成像、基因编辑、器官芯片、生物打印、微流体等技术互相融合。Geyer等［67］利用基于微流体的胰腺导管腺癌类器官系统揭示了缺氧条件对治疗效果的影响。Tran等［68］通过实时成像技术筛选出了247种能够阻止囊肿形成但不抑制类器官生长的蛋白酶抑制剂。因此,“类器官+”技术将为生物医学发展可能会遇到的问题给出新的解答方法。

综上所述,类器官已经应用于诸多领域,成为精准医疗、药物开发、发育和疾病机制研究、再生医学等领域不可或缺的基石。