刺梨与无籽刺梨果实中药化学成分及抗氧化物质的比较分析

蒋兰兰　鲁敏　安华明

关键词：刺梨；无籽刺梨；次生代谢物；中药化学成分；抗氧化物质

中图分类号：S661.9 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）01-0111-15

代谢组学于20世纪70年代由Devaux等提出，主要研究生物体内源代谢物的种类、含量及其变化规律等。代谢物是生物体表型的基础，代谢水平可作为生物体对环境变化和遗传修饰的终端响应，通过其能更直观有效地了解生物学过程及其机制。植物代谢组学主要研究植物不同基因型及不同发育时期，或在受到某些刺激或胁迫前后代谢物的相应变化，包括其种类及含量，进而发现或验证一些基因及蛋白的功能，有助于进一步阐明多种植物天然产物的生物合成途径。目前，代谢组学已应用于植物研究的多个方面，如不同芝麻品种间的营养差异、四季豆的抗病性、野生稻与栽培稻之间的代谢物差异。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）与无籽刺梨（R.sterilisS.D.Shi）均是蔷薇科蔷薇属多年生落叶果树，主要分布于中国西南地区，其中贵州省刺梨种质资源丰富。在笔者研究组收集的多个优异刺梨种质资源中，Rr-3与多个刺梨基因型间的代谢物差异较小，更具代表性，且单果质量较大，有望成为贵农5号的补充栽培资源，以促进刺梨产量的提高。此外，研究表明刺梨与无籽刺梨果实均富含生物活性物质，包括酚酸、黄酮、有机酸、氨基酸和维生素C等。据《本草纲目拾遗》《中药大辞典》等记载，刺梨花、果、叶、根、籽可入药，有健胃、消食、滋补作用，根皮有止泻的功效等。刺梨还具抗癌、预防动脉粥样硬化和抗氧化等功效。时京珍等研究发现，刺梨与无籽刺梨的药理作用相似，均具有抗炎及镇痛作用。但两者间的营养成分及活性物质含量均有差异；刺梨的维生素C及必需氨基酸含量高于无籽刺梨，被认为具较高营养价值；与刺梨相比，无籽刺梨具较高的总黄酮与总酚含量。在刺梨与无籽刺梨代谢物研究中，刺梨具较高的儿茶素与杨梅素含量；而金刺梨酒石酸和槲皮素含量较高。研究表明刺梨与无籽刺梨的主要香气物质也存在差异。此前已有研究检测并鉴定了刺梨果实次生代谢物及中药化学成分；而无籽刺梨的次生代谢物研究多集中在酚酸、黄酮、萜类、氨基酸与挥发性物质等方面，其中药化学成分暂不清楚；因此，笔者在本研究中采用广泛靶向代谢组学技术检测和鉴定无籽刺梨果实的次生代谢物及中药化学成分。此外，研究表明，相较无籽刺梨，刺梨具更高抗氧化能力，但对刺梨及无籽刺梨中具抗氧化能力次生代谢物的研究主要集中在酚酸、黄酮、三萜及有机酸等分类方面，而研究表明鞣质也具有较高的抗氧化能力，因此笔者在本研究中以2个刺梨基因型（Rr-5，Rr-3）与Rs果实为试材进行代谢物分析，明确刺梨与无籽刺梨次生代谢物中的中药化学成分及抗氧化物质并分析其间的差异，为促进刺梨与无籽刺梨的合理应用提供理论参考。

1材料和方法

1.1材料

以无籽刺梨（R.sterilisS.D.Shi，简称Rs）与两个刺梨（R.roxburghii Tratt.）基因型[贵农3号（Gui-nong 3，简称Rr-3）和贵农5号（Guinong 5，简称Rr-5）]的成熟果实为试验材料。果实样品均采自贵州省贵阳市花溪区贵州大学刺梨种质资源圃（106°67.353′E，26°42.408′N），每个样本均来源于连续面积为3.35hm2的刺梨圃中生长良好且树龄均为4～5 a（年）的植株。从各基因型的3棵树的4个方向的树冠边缘采集3个果实作为生物学重复；每个生物学重复包括12个果实。采集后立即去籽在液氮中快速冷冻，并于-80℃下储存备用。

1.2样品前处理

首先将供试样品放置于冻干机（Scientz-lOOF）中真空冷冻干燥；后使用研磨仪（MM400，Retsch）以30 Hz研磨1.5 min;称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL70%（p）甲醇提取液中；溶解后的样品于4℃冰箱过夜，期间涡旋6次；以12000r·min^-1离心10 min后，取上清，用微孔滤膜（0.22μm pore size）过滤样品，保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析

液相条件-色谱柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm×100 mm;流动相：A相为超纯水（加入0.1%甲酸），B相为乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脱梯度：0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%并维持1 min，10.00～11.10 min，B相比例降为5%并平衡至14min;流速0.35mL·min^-1;柱温40℃；进样量4μL。

质谱条件-电喷雾离子源温度550℃，质谱电压5500 V（正模式）/-4500 V（负模式），帘气25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆中，每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.4中药化学成分及抗氧化能力

将刺梨与无籽刺梨果实中检测到的次生代谢物在中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chi-nese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）进行查询，筛选出中药化学成分并找出其对应的靶点及疾病。后根据生物口服利用度（0B≥5%）、药物相似性（DL≥0.14）进一步筛选关键活性成分。将所有代谢物在系统药理学抗癌草药数据库中查询（CancerHSP，其中抗癌草药2439种，抗癌成分3575种），鉴定其中抗癌朋中瘤成分。在TCMSP数据库的疾病名称菜单中输入“糖尿病”“心血管疾病”“高血压”“动脉粥样硬化”和“血栓性疾病”。然后下載每种抗病物质的相关成分。最后，将UPLC-MS/MS中鉴定出的代谢物与获得的抗病相关成分进行比较，鉴定出试样中抗5种疾病相关的活性药物成分。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-pic-rylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除活性、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2-Azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]阳离子自由基清除活性和铁离子还原活性（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定参考Moure等、Martinez-Villaluenga等和Benzie等的方法且略有调整；其中Rr的3种抗氧化能力数据由Rr-3与Rr-5求和后取平均值而得。并将代谢物相对含量与三种抗氧化能力进行相关性分析，鉴定出刺梨与无籽刺梨中主要的抗氧化代谢物。

1.5数据分析

基于自建数据库MWDB（metware database），根据二级谱信息进行物质定性，获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。采用多元数据统计分析，对样本进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析和正交偏最小二乘判别分析（or-thogonal PLS-DA，OPLS-DA）。结合差异倍数值和OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable impor-tance in projection，VIP）值筛选差异代谢物。筛选标准：选取fold change≥2和fold change≤0.5，且VIP≥1。对所测抗氧化能力利用SPSS进行单因素方差分析，并对抗氧化能力与代谢物相对定量进行皮尔逊相关性分析。

2结果与分析

2.1次生代谢物总体分析

通过对质控样本（quality control sample，QC）质谱检测分析的总离子流图（图1-A）及多反应监测模式的代谢物检测多峰图（图1-B）进行展示分析，可以判断代谢物提取和检测的结果稳定，数据可靠且重复性良好。笔者在本研究中共检测到12类530种次生代谢物，其中包括99种脂质，90种酚酸，64种氨基酸及其衍生物，62种黄酮，57种鞣质，40种核苷酸及其衍生物，34种有机酸，23种萜类，14种生物碱，7种木脂素和香豆素，1种醌类和39种其他物质（表1）。

所有样本的主成分分析结果如图1-C所示，每组的3个重复样本明显聚集，组间明显分离。与PCA结果一致，3个样本的相对定量热图也具有明显差异（图1-D）。结果表明，刺梨和无籽刺梨的代谢物存在明显差异。因此，进一步分析刺梨与无籽刺梨的特有代谢物。分析表明，刺梨与无籽刺梨间存在较大差异，31种代谢物仅在刺梨中检测到，包括10种单宁、8种酚酸、4种黄酮类化合物、4种核苷酸及其衍生物、1种有机酸、1种木脂素和香豆素以及3种其他代谢物（表1）。齐墩果酸-O-己糖-O-己糖、对氨基苯甲酸、红车轴草素-7-0-吡喃葡萄糖苷和4-a-L-鼠李糖苷一鞣花酸这4种物质仅在无籽刺梨中检测到。这些物质可被作为区分刺梨与无籽刺梨的生物标志物。

2.2中药化学成分鉴定

由于两类果实中具健康促进作用的次生代谢物尚不清楚。因此，笔者在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中进一步查询，鉴定刺梨与无籽刺梨果实中药化学成分及关键活性成分。结果表明，530种次生代谢物中有118种是中药化学成分（包括25种酚酸，16种鞣质，12种核苷酸及其衍生物，12种氨基酸及其衍生物，12种黄酮，11种有机酸，9种其他，8种脂质，7种萜类，3种生物碱，3种木脂素与香豆素），其中91种成分对应347种靶点及359种疾病（表2）。在118种中药化学成分中，36种是关键活性成分，其中11种代谢物（罗布麻酸、二十碳烯酸、西索林、尿苷5-二磷酸、鸟苷、绿原酸、2a-羟基熊果酸、狭窄素、肉豆蔻酸、特卡坦、双子D）没有相应的靶点和疾病（表2）。因此，可对这些物质进行深入研究，探索其药用价值，以用于新药研发。更重要的是，丁香油酚甲醚、黄嘌呤、苯甲酸、特里马素I、Tercatain、Glansrin C和水杨梅丁素仅在一个或两个刺梨基因型中检测到，且Terca-tain和水杨梅丁素是关键活性成分。因此，这些物质可被认为是刺梨与无籽刺梨间药用价值差异的主要成分。以上结果表明，刺梨比无籽刺梨具更高的药用价值。

目前，世界范围内威胁人类健康的主要疾病包括癌症朋中瘤、糖尿病、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化和血栓性疾病。为鉴定刺梨与无籽刺梨果实中抗六大疾病的活性成分，笔者对检测的代谢物进行CancerHSP及TCMSP数据库查询。结果表明，刺梨及无籽刺梨果实中共有46种代谢物（包括15种黄酮，11种酚酸，8种鞣质，4种萜类，2种氨基酸及其衍生物，2种核苷酸及其衍生物，2种生物碱，2种有机酸）至少对应一种疾病，其中迷迭香酸对应六大疾病，还有多种代谢物对应3～4种疾病（表3）。更重要的是，山奈酚-3-0-（6”-O-乙酰）-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6”-丙二酰）一半乳糖苷仅在刺梨中检测到，且分别对应4种与2种疾病。

2.3抗氧化能力分析及抗氧化物质鉴定

由图2-A可知，Rr的3种抗氧化能力均显著高于Rs（p<0.05）。但其中主要的抗氧化物质并不清楚。分析表明，笔者在本研究中检测到的530种次生代谢物中，145种物质与抗氧化能力显著相关，包括38种鞣质、27种氨基酸及其衍生物、23种酚酸、18种核苷酸及其衍生物、13种黄酮、5种有机酸、4种三萜、3种木脂素与香豆素、3种脂质、2种生物碱和9种其他物质（包括维生素C）（图2-B）。仅在刺梨中检测到的物质有20种，而1-0-没食子酰-a-L-鼠李糖、2-0-二没食子酰基-β-D-葡萄糖-β-D-葡萄糖、Glansrin C、1-O-，B- D-（3，4-二羟基苯乙基）-O-咖啡酰基-葡萄糖苷、3，5-二-O-没食子莽草酸和原花青素三聚单酯、Tercatain，特里马素I和对香豆酰酒石酸这9种代谢物与3种抗氧化能力均显著相关（p<0.05）。而仅在无籽刺梨中檢测到的4种代谢物均与抗氧化能力呈负相关。这一结果与测得的两类果实的抗氧化能力结果一致。因此，笔者认为刺梨具有更高的抗氧化能力，且富含更多具有抗氧化能力的次生代谢物。

2.4差异代谢物筛选及差异代谢通路分析

通过对代谢物数据进行多元统计分析，基于OPLS-DA结果（图3-A，C）及获得的多变量分析OPLS-DA模型的VIP，同时结合差异倍数值来筛选差异代谢物。由火山图可见，Rr-3与Rs间有272种差异代谢物（图3-B），Rr-5与Rs间有242种差异代谢物（图3-D），而两个比较组间筛选出171种共有的差异代谢物，包括37种鞣质、34种酚酸、21种核苷酸及其衍生物、20种黄酮、18种氨基酸及其衍生物、13种脂质、8种有机酸、7种萜类、4种木脂素和香豆素、1种生物碱与8种其他物质（图3-E）。其中111种代谢物在刺梨中的相对定量相较于Rs来说是上调的，其中有87种抗氧化物质及31种中药化学成分（分类如下：12种鞣质，7种核苷酸，4种有机酸，4种酚酸，2种氨基酸，1种其他，1种萜类），且其中8种差异代谢物是关键活性成分，分别是双没食子酸、腺苷、鸟苷、腺苷-3-5-环单磷酸水合物、鞣花酸、水杨梅丁素、Tercatain和Myrianthic acid；其中23种物质既是抗氧化物质也是中药化学成分（丙二酸，胞嘧啶，组胺，延胡索酸，胸腺嘧啶，三一谷氨酸，黄嘌呤，吡哆素，没食子酸，没食子酸甲酯，芥子醇，尿嘧啶核苷，鸟苷，鞣花酸，双没食子酸，迷迭香酸，水杨梅丁素，英国栎鞣花酸，特里马素I，Glansrin C，Pterocarinin A，Glansrin A，PlatycaryaninA）。而Rs中上调的差异代谢物有53种，其中仅10种差异代谢物（3种酚酸，2种黄酮，2种有机酸，1种脂质，1种木脂素与香豆素，1种其他物质）是中药化学成分，仅3个关键活性成分，分别是石榴酸、绿原酸和樱桃苷。

根据2个刺梨基因型与无籽刺梨比较筛选出的差异代谢物进一步进行差异富集通路分析。结果表明，Rr-3与Rs间272种差异代谢物共注释到73条代谢通路；Rr-5与Rs间242种差异代谢物共注释到66条代谢通路；在两个刺梨与无籽刺梨的差异代谢物富集的差异代谢通路中，前5条高富集程度的代謝通路是嘌呤代谢、嘧啶代谢、玉米素生物合成、碳代谢和氨基酸生物合成（图4）。这一结果表明上述5条差异代谢通路可能被认为是刺梨与无籽间主要的差异代谢通路。

3讨论

笔者首次鉴定并比较分析了两类果实的中药化学成分及抗氧化物质。前人研究主要集中在两类果实挥发性物质、酚酸、氨基酸和黄酮类代谢物中，但其中药化学成分及抗氧化物质尚不清楚。而刺梨与无籽刺梨在市场上常被混用，研究表明无籽刺梨与刺梨及不同刺梨基因型间的营养价值、药用价值及抗氧化能力存在显著差异。因此，笔者基于广泛靶向代谢组学技术对刺梨及无籽刺梨果实的次生代谢物进行检测，鉴定并比较分析其中药化学成分及抗氧化物质差异。

在不同刺梨基因型代谢物研究中，检测到723种次生代谢物，鉴定出172种中药化学成分及41种抗氧化物质。笔者在本研究中共检测到530种次生代谢物，31种物质仅在刺梨中检测到，4种仅在无籽刺梨中检测到；鉴定出118种中药化学成分（关键活性成分36种）及145种抗氧化物质，其中数量较多的均是鞣质与酚酸类代谢物，表明酚类物质在刺梨与无籽刺梨果实的中药活性及抗氧化能力中起重要作用。此外，笔者还发现91种中药化学成分对应347个靶点及359种疾病。进一步分析发现其中46种物质对6大疾病中的一种或多种疾病具抗性，而迷迭香酸对6种疾病均有抗性。由于其采样、送检时间的不同，迈维数据库有所更新，因此两次试验检测到的次生代谢物数量存在差异，而笔者检测到的部分代谢物在上述研究中均未检测到，丰富了两类果实中次生代谢物的种类及数量。并深入挖掘了其中抗六大疾病的次生代谢物与中药化学成分及其靶点与疾病，首次鉴定了无籽刺梨果实的中药化学成分。

前人研究表明，刺梨果实中总酚、总黄酮及总三萜与抗氧化能力显著相关，其中2种有机酸、5种鞣花酸及其衍生物、11种黄酮类化合物和1种三萜类化合物，是促进刺梨果实提取物抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的主要化合物。刺梨具较高抗氧化能力很大程度上归因于有机酸与酚类化合物，如没食子酸、儿茶素、表儿茶素和表没食子酸，由于羟基数量较多，它们可以作为良好的电子供体发挥自由基清除作用断。刺梨果实中主要的抗氧化物质的研究结果表明11种酚酸、9种黄酮及21种萜类物质与抗氧化能力显著相关。上述研究表明酚酸类、类黄酮类及萜类物质是刺梨果实中主要的抗氧化物质。笔者在本研究中发现145种次生代谢物分别与至少一种抗氧化能力显著相关，其中鞣质类物质数量最多，其次是氨基酸及其衍生物与酚酸类物质。鞣质化学结构复杂，是具较高抗氧化能力的酚类物质，测定的总酚含量中包含鞣质。此前的研究均表明刺梨总酚含量与抗氧化能力显著相关，与本研究结果一致。且笔者进一步挖掘出刺梨与无籽刺梨果实中主要的抗氧化物质。更重要的是，仅在刺梨果实中检测到的代谢物中有20种抗氧化物质{1-O-没食子酰-a-L-鼠李糖，异木犀草素，4-[3-羟基-2-[4-[（2s，3s）-3-（羟甲基）-5-（3-羟基丙基）-7-甲氧基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-2-基]-2，6-二甲氧基苯氧基]丙基]-2-甲氧基苯酚，山奈酚-3-0-（6”-O-乙酰）-葡萄糖苷，Praecoxin D，2-O-二没食子酰基-β-D-葡萄糖-β-D-葡萄糖，Glansrin C，黄嘌呤，鞣花酸戊糖苷二聚体，吡哆醇O-二己糖苷，1-D-β-D-（3，4-二羟基苯乙基）-O-咖啡酰基-葡萄糖苷，3，5-二-O-没食子莽草酸，原花青素三聚单酯，二磷酸腺苷，（EC→EC→EC）g（1），Tercatain，特里马素I，水杨梅丁素，山奈酚-3，7-O-二鼠李糖苷，对香豆酰酒石酸}，7种中药化学成分（丁香油酚甲醚，黄嘌呤，苯甲酸，特里马素I，Tercatain，Glansrin C，水杨梅丁素）及2种抗六大疾病物质（Tercatain，水杨梅丁素）。而仅在无籽刺梨中检测到的代谢物既没有中药化学成分也没有抗氧化物质。以上结果进一步说明刺梨具更高的药用价值及抗氧化能力。黄嘌呤、特里马素I、Tercatain、Glansrin C、水杨梅丁素这5种物质是刺梨特有的抗氧化物质及中药化学成分，且Tercatain和水杨梅丁素也是抗六大疾病活性物质。因此，这5种物质在刺梨与无籽刺梨果实中药活性及抗氧化能力的差异中均起重要作用。

在两个刺梨基因型与无籽刺梨的差异代谢物分析中，Rr-3与Rs间有272种差异代谢物，Rr-5与Rs间有242种差异代谢物。上述差异代谢物映射到KEGG富集通路，富集程度较高的是嘌呤代谢、嘧啶代谢、玉米素生物合成、碳代谢、氨基酸生物合成。嘌呤可参与植物氮代谢、黄酮合成及激素合成过程，帮助植物应对不良环境；嘌呤和嘧啶核苷酸参与植物的许多生化過程，包括发芽开花结实等，它们是核酸合成的基石，是合成初生代谢物以及次生代谢物的前体；此外，植物嘌呤和嘧啶代谢的重要过程是初级代谢、次级代谢和基因表达所必需的，是细胞生长和生化过程的基础。而映射到这两条通路中的差异代谢物均在刺梨中上调，因此，笔者认为嘌呤代谢及嘧啶代谢通路的差异是刺梨与无籽刺梨在种子上差异的原因之一，并推断刺梨比无籽刺梨具有更高的对逆境胁迫的耐受性。

差异代谢物中有171种是Rr-3、Rr-5与Rs共同差异的物质，其中，在两个刺梨基因型均上调的差异代谢物有111种，包括87种抗氧化物质（31种鞣质，15种核苷酸及其衍生物，12种酚酸，10种鞣质，7种黄酮，5种其他，2种脂质，2种萜类，2种有机酸，1种木脂素与香豆素），31种中药化学物质，8种关键活性成分，23种物质既是抗氧化物质又是中药化学物质（丙二酸，胞嘧啶，组胺，延胡索酸，胸腺嘧啶，L-谷氨酸，黄嘌呤，吡哆素，没食子酸，没食子酸甲酯，芥子醇，尿嘧啶核苷，鸟苷，鞣花酸，双没食子酸，迷迭香酸，水杨梅丁素，英国栎鞣花酸，特里马素I，Glansrin C，Pterocarinin A， Glansrin A， PlatycaryaninA）；无籽刺梨中上调的有53种物质，包括10种中药化学成分，3种关键活性成分。综上，与无籽刺梨相比，刺梨具更高的中药活性及抗氧化能力，其差异主要源于两类果实中酚类物质数量与含量的不同。

4结论

笔者在本研究中首次对刺梨及无籽刺梨果实次生代谢物中的具中药活性与抗氧化能力的次生代谢物进行鉴定与差异分析。结果表明，在两个刺梨基因型与无籽刺梨果实中共检测到530种次生代谢物，其中包括118种中药化学成分与145种抗氧化物质，酚类物质是刺梨及无籽刺梨果实中最主要的抗氧化物质与中药化学成分；刺梨不论是在特有物质中还是在差异代谢物中均具较多数量的抗氧化物质及中药化学成分，从而具更高的中药活性及抗氧化能力，而酚类物质的数量及含量是导致刺梨与无籽刺梨抗氧化能力及中药活性差异的主要原因。