尕海湿地区沼泽草甸退化对土壤氮转化酶活性的影响

常文华，马维伟，李广，徐国荣，龙永春

（甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070）

土壤酶是土壤生态系统中的重要组成部分，主要来源于动植物微生物分泌及其残体分解，推动着土壤生态系统的养分循环和能量流动［1］。土壤氮转化酶是固氮、硝化和反硝化等氮的周转和矿化过程的主要生物催化剂，也是土壤氮循环的主要限制因素之一［2］，其中土壤脲酶能将尿素水解成氨，蛋白酶能够促使蛋白质物质转化为氨基酸，硝酸还原酶及亚硝酸还原酶可直接参与土壤的反硝化过程［3］。土壤酶活性能够反映土壤碳氮磷循环速率的强弱，其活性大小不仅受制于植被类型、土壤环境状况、土层深度、微生物活性和养分可利用性等因素的影响，而且还与凋落物降解及养分归还等密切相关［4］。土壤氮转化酶活性不仅能反映土壤微生物养分含量需求以及生化反应过程的强度与方向，而且能够反映土壤氮素累积与分解转化的规律［5］，研究其活性变化对于理解土壤氮转化过程具有重要意义。

全球气候变暖及过度放牧导致青藏高原地区部分生态系统的退化直接影响植物、土壤理化特征与土壤微生物活性，从而影响土壤酶活性［6］。研究表明，高寒生态系统退化演替，引起区域植被、土壤等环境因素变化，一定程度影响了相关土壤酶活性［7-8］，但在不同土层深度影响程度不同。如刘育红［9］在高寒草甸的研究发现，表层土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性在退化条件下的变化剧烈。蒋永梅等［10］在祁连山高寒草地的研究发现，土壤酶活性随退化梯度加剧与土层加深均呈减小的趋势，且随退化程度的进一步加剧，表层土壤酶活性降低趋势愈发明显；Ma等［11］对高寒湿地的研究表明，植被退化仅显著降低了0～20 cm土层的土壤蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，这些研究在一定程度上揭示了高寒生态系统退化对土壤酶活性及其土层深度分布的影响。然而，不同生态系统存在不同土壤类型、土壤养分、植被状况等因素，导致土壤酶活性不同；同时同一类型不同深度的土壤酶活性对生态系统退化响应的敏感性也存在差异。尽管学者对高寒生态系统土壤酶活性做了大量研究，但关于高寒生态系统退化演替对土壤酶活性及其土层深度分布的影响研究仍较缺乏。

位于青藏高原东缘的尕海湿地是响应全球气候变化最敏感的区域之一，区域内沼泽草甸分布面积高达80%以上。但近年来受气候、水文变化以及过度放牧等不合理的人类活动影响，沼泽草甸退化严重［12］，引起植被旱生化、水分含量、碳汇功能降低以及土壤碳、氮组分含量显著减小等环境变化［13］，这些环境因素的变化将会使得土壤酶活性被打破，进而影响土壤养分循环过程。目前，尕海湿地沼泽草甸植被与土壤均表现出从水生向陆生渐进式演替的退化趋势［14］，但尚不明确：土壤氮转化酶活性在沼泽草甸退化过程中的变化规律如何？哪一层变化最为显著？土壤酶活性发生变化的关键驱动因子是什么？鉴于此，本研究以尕海湿地不同退化沼泽草甸为研究对象，分析比较不同退化程度不同深度土壤氮转化酶活性的差异性，揭示沼泽草甸退化对土壤氮转化酶活性及其土层分布的影响，为理解全球气候干暖化背景下高寒湿地生态系统土壤酶活性变化规律提供基础数据，也为深入理解高寒生态系统土壤氮循环过程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区地处青藏高原东缘，位于甘肃省甘南藏族自治州碌曲县尕海自然保护区境内，地理坐标为33°58′-34°32′N，102°05′-102°47′E，海拔3430～4300 m，区域总面积为58067 hm2，其中沼泽草甸约占总面积的88%。气候属青藏高原气候带大陆性季风气候，年均气温为1.2℃，最高气温为10.5℃（7月），最低气温为-9.1℃（1月），年均降水量为782 mm，蒸发量为1150 mm。植物种类主要有藏嵩草（Kobresia tibetica）、蕨麻（Potentilla anserina）、早熟禾（Poa annua）、棘豆（Oxytropis falcata）、青 藏 苔 草（Carex moorcroftii）、冷 蒿（Artemisia frigida）、兰 石 草（Lancea tibetica）、珠 芽 蓼（Polygonum viviparum）等［15］。土壤类型主要以高山草甸土、暗色沼泽土与泥炭土为主。

1.2 样地设置

本研究在团队前期研究工作的基础上，选择尕海湿地沼泽草甸为研究对象，以尕海湖为中心沿原生湿地向外延伸设置退化程度，根据植被优势种组成、盖度、高度、地上生物量、地表裸露程度等特征，将研究区域划分为未退化（non-degraded，ND）、轻度退化（light degraded，LD）、中度退化（moderate degraded，MD）和重度退化（heavy degraded，HD）4种退化类型，并在每种退化程度内布设3块10 m×10 m的研究样地，同一退化程度样地间至少保留5 m间隔，共12块样地，设置木栏围挡以防止人畜干扰。样地基本情况见表1。

表1 样地基本情况Table 1 Basic information of the sample plot

1.3 样品采集

本试验野外取样工作于2020年8月开展，采用直径5 cm的土钻按照“S”型5点法分别采集0～10 cm、10～20 cm和20～40 cm土样，相同退化程度同一土层组成一份混合土样，去除土壤中颗粒物与植物根系，放入自封袋内，带回实验室。取一部分鲜土在4℃样品储存室保存，用于土壤铵态氮、硝态氮与微生物生物量氮含量的测定，另一部分置于室内自然风干后过2 mm筛，用于土壤氮转化酶活性及其他指标测定（重复3次）。

1.4 样品测定

采用半微量凯氏定氮法测定土壤全氮（total nitrogen，TN）含量；采用MgO-代氏合金蒸馏法测定铵态氮（ammonium nitrogen，NH4+-N）与硝态氮（nitrate nitrogen，NO3--N）含量；采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定微生物生物量氮（microbial biomass nitrogen，MBN）含量［16］；采用尿素比色法测定土壤脲酶活性（urease activity，URE）；采用茚三酮比色法测定蛋白酶活性（protease activity，PRO）［17］；采用苯磺酸-醋酸-α萘胺比色法测定硝酸还原酶活性（nitrate reductase activity，NR）与亚硝酸还原酶活性（nitrite reductase activity，NIR），测定参考武志杰等［18］的 方 法。采 用EM 50数 据 收 集 系 统（decagon Devices，Inc.，NE，美国）监测土壤温度与含水量数据，每间隔10 min自动记录一次数据。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0进行数据整理与统计检验分析。通过单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法分析检验不同退化程度各研究指标的差异显著性；通过双因素方差分析（Two-way ANOVA）对退化程度、土层深度及其交互作用对土壤氮转化酶活性影响进行比较；利用Canoco 5.0对土壤氮转化酶活性和环境因子进行去趋势分析（detrended correspondence analysis，DCA）后，进行冗余分析（redundancy analysis，RDA），并使用蒙特卡洛检验（monte carlo permutation test）逐步筛选影响土壤氮转化酶活性变化的主导因素。使用Origin 2020进行绘图，图表中数据均为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 不同退化沼泽草甸对土壤温湿度变化的影响

在0～40 cm土层中，随退化程度加剧，土壤含水量、全氮、铵态氮与微生物生物量氮含量降低，土壤温度和硝态氮含量增加（表2）；除铵态氮与硝态氮外，各退化程度的土壤含水量、温度、全氮与微生物生物量氮含量均与ND相比存在显著差异（P＜0.05）。此外，0～10 cm土层土壤温度、全氮、铵态氮与微生物生物量氮含量均最高，且各退化程度沼泽草甸土壤温度、全氮与微生物生物量氮含量均随土层加深而逐渐降低；ND、LD的土壤铵态氮、硝态氮分别均在0～10 cm和20～40 cm土层最高，而MD相应值最高出现在0～10 cm和10～20 cm土层，HD却分别出现在10～20 cm和20～40 cm土层。

表2 不同退化程度沼泽草甸土壤理化性质Table 2 Soil physicochemical properties of marsh meadows with different degrees of degradation

2.2 不同沼泽草甸退化程度土壤氮转化酶活性分布特征

随退化程度的加剧，0～40 cm土层土壤脲酶活性和硝酸还原酶活性均显著增加，而土壤蛋白酶活性和亚硝酸还原酶活性显著降低（图1）。沼泽草甸退化对不同土层的酶活性影响不尽相同，在0～10 cm土层，与ND相比，LD脲酶活性减少了2.73%，而MD和HD却分别显著增加了9.59%和15.50%（P＜0.05）；LD、MD和HD蛋白酶活性与亚硝酸还原酶活性分别显著减少了8.05%、9.93%、13.74%和4.56%、15.21%、26.94%（P＜0.05）；硝酸还原酶活性却显著增加至1.24、2.08和7.65倍。在10～20 cm与20～40 cm土层，脲酶和硝酸还原酶活性随退化程度加剧逐渐增加，蛋白酶和亚硝酸还原酶活性却明显减小。统计分析显示，土壤脲酶与蛋白酶活性在10～20 cm土层中仅ND与HD间差异显著（P＜0.05），而在20～40 cm土层中ND与LD、MD和HD间均存在显著差异（P＜0.05）；10～20 cm与20～40 cm土层硝酸还原酶活性ND与LD、MD、HD间均存在显著差异（P＜0.05），而10～20 cm土层亚硝酸还原酶活性仅ND与MD和HD间差异显著（P＜0.05）。

图1 不同退化程度土壤氮转化酶活性变化Fig.1 Changes in soil nitrogen invertase activity with different degrees of degradation

在垂直剖面上，随土层深度的增加，土壤脲酶、蛋白酶和除HD外的亚硝酸还原酶活性均显著降低，而土壤硝酸还原酶活性显著增加（HD降低）。除土壤脲酶与硝酸还原酶活性在LD中差异不显著外，其余土壤酶活性在不同土层间均存在显著差异（P＜0.05）。方差分析结果表明（表3），退化程度和土层深度对土壤脲酶、蛋白酶、硝酸酶和亚硝酸酶活性均存在极显著影响（P＜0.01），而退化程度和土层深度仅对土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性存在显著交互作用（P＜0.05）。

表3 退化程度和土层交互作用下土壤氮转化酶活性方差分析Table 3 Variance analysis of soil nitrogen invertase activity under degradation degree and soil layer interaction

2.3 土壤理化因子对土壤氮转化酶活性的影响

利用土壤氮转化酶活性数据进行DCA分析，所有轴中Axis Lengths的结果均小于3.0，因此采用冗余分析（RDA）排序模型。冗余分析表明（表4），第1排序轴、第2排序轴的解释贡献度分别为75.41%和4.72%，即前两轴中的总方差解释度为80.13%，表明前两轴能够较好地反映土壤氮转化酶活性与理化因子的关系，且主要由第1排序轴决定；前两轴与土壤理化因子的相关系数分别为0.909和0.751，累积解释量达到99.98%，表明排序效果良好。二维排序图显示（图2），SWC、NO3--N与TEM的箭头投影连线较长，说明不同退化沼泽草甸中土壤氮转化酶活性变化主要受其影响。其中，URE与NH4+-N、MBN、NO3--N和TEM呈显著正相关，与TN、SWC呈显著负相关；PRO与NO3--N呈显著负相关，与其余指标间均呈显著正相关；NO3--N、TEM与NR呈显著正相关，而与NIR呈显著负相关；TN、NH4+-N、MBN和SWC与NR呈显著负相关，而与NIR呈显著正相关。

图2 土壤氮转化酶活性与理化因子的冗余分析Fig.2 RDA analysis of soil nitrogen invertase activity and soil physicochemical properties

表4 土壤氮转化酶活性RDA排序的特征值及解释量Table 4 Eigenvalues and interpretations of RDA ranking of soil nitrogen invertase activity

冗余分析排序图仅反映出土壤氮转化酶活性与理化因子间存在相关性，但难以量化理化因子对土壤氮转化酶活性的贡献程度。为此，本研究采用蒙特卡洛检验和前向选择排序法对土壤理化因子进行排序。由表5可知，各理化因子对土壤氮转化酶活性的影响重要性排序从大到小依次为SWC、NO3--N、TEM、TN、MBN、NH4+-N。其中SWC、NO3--N、TEM与TN对土壤氮转化酶活性具有显著影响（P＜0.05），其余因子的影响未达显著水平，而SWC对土壤氮转化酶活性的贡献率高达67.1%。可见，土壤含水量是影响尕海湿地沼泽草甸退化演替过程中土壤氮转化酶活性变化的最主要的驱动因素。

表5 土壤理化因子解释量及显著性检验Table 5 Ranking results of importance of interpretation of soil physical and chemical properties

3 讨论

3.1 沼泽草甸退化对土壤氮转化酶活性分布特征的影响

高寒生态系统沼泽草甸的退化主要是由生态系统能量流动与物质循环间的不平衡所造成，而土壤酶在土壤物质循环过程中具有重要的驱动作用，因此土壤酶对退化演替表现较为敏感，在生态系统退化演替中具有指示剂作用［19］。土壤脲酶和蛋白酶是参与土壤有机氮向无机氮转化的关键水解酶，主要来源于植被和土壤微生物活动的分泌释放，进一步驱动土壤氮素的分解、转化过程［20］。土壤脲酶能促进土壤中的尿素水解成氨，脲酶活性大小常用来表征土壤氮素转化的强度［21］。本研究表明，尕海湿地沼泽草甸退化显著增加了土壤脲酶活性，与徐静静等［22］在巴音布鲁克天鹅湖高寒湿地的研究结果相同，原因可能是与全氮含量有关，全氮含量过高会抑制脲酶的分泌［23］；此外，脲酶活性也受土壤含水量的影响，随退化程度加剧，土壤中的含水量逐渐减少，微生物所能吸收利用的水分降低，从而提高了土壤中尿素浓度，由于尿素是土壤脲酶能够催化的唯一底物来源，使得土壤微生物对尿素利用资源能力加强，促使土壤脲酶活性升高。土壤蛋白酶能够促使蛋白质、肽类水解为氨基酸，与脲酶共同作用参与土壤氮素转化，是土壤氮素供给能力的重要表征［24］。本研究中土壤蛋白酶活性与脲酶活性变化趋势相反，原因与退化加剧降低了蛋白酶底物来源有关［20］。随退化程度加剧，地表植被覆盖度、高度及物种丰富度大幅度下降，地上生物量减小，植被枯落物与分泌物相应减少，代谢产酶能力减弱，蛋白酶活性降低；此外沼泽草甸退化致使地表土壤裸露程度增大，蓄水保水能力降低，土壤水分含量减少，导致土壤干燥，减少了酶促反应进行的条件与场所［25］，最终抑制了土壤蛋白酶活性，这与黄海莉等［26］的研究结果一致，说明尕海湿地沼泽草甸退化加剧在一定程度上限制了蛋白酶底物的来源与其扩散速率，致使蛋白酶活性随之降低。

土壤反硝化酶（土壤硝酸还原酶、亚硝酸还原酶等）将土壤中的硝酸盐、亚硝酸盐等含氮物还原成N2、NO和N2O等，在土壤氮素反硝化过程中具有重要催化作用［27］。土壤反硝化酶活性受制于温度、水分、溶解氧、pH和底物浓度等因素的影响，能够体现土壤反硝化能力的强弱［28］。本研究发现，随沼泽草甸退化程度加剧，土壤硝酸还原酶活性增大，而亚硝酸还原酶活性减小，这是由于土壤硝酸还原酶是催化反硝化过程中的最初的酶，能够将NO3-还原为NO2-，而土壤亚硝酸还原酶是反硝化过程中的中间限速酶，催化NO2-还原为NO［29］。随沼泽草甸退化加剧，土壤中好氧微生物消耗一部分氧气，导致土壤含氧量下降，反而刺激适合低氧环境生长繁殖的反硝化细菌增加，直接促使土壤硝酸还原酶活性升高。土壤硝态氮以底物形式参与土壤反硝化作用，在土壤微生物及酶的作用下不断进行反硝化作用，随退化加剧硝态氮降低，底物含量的减少，进而使其诱导亚硝酸还原酶的合成速率减弱［30］，亚硝酸还原酶活性相应降低。尕海湿地沼泽草甸随退化程度变化，导致地表植被类型、微生物代谢作用、土壤微环境以及土壤碳氮循环等发生变化，进而造成土壤氮转化酶活性存在差异。

高寒生态系统土壤的土层厚度较浅，植被相对稀疏，根系较浅且不发达，因此植被退化对土壤环境因子的剖面分布影响尤为突出。尕海湿地沼泽草甸退化过程中对表层土壤的影响往往大于对较深土层的影响，这与大多数学者所认为土壤酶活性存在表层富集效应的结果相同［31］。本研究发现，表层土壤脲酶、蛋白酶与亚硝酸还原酶活性在生态系统退化下的变化剧烈，并且均呈0～10 cm＞10～20 cm＞20～40 cm趋势。土壤酶活性在垂直剖面上的降低存在多方面的原因，首先是由于本区域植被类型以草本植物为主，植物根系主要集中在土壤表层［11］，表层能够获得较多的植被枯枝落叶物与腐殖质，有利于微生物生长，其代谢作用活跃，在一定程度上提高了土壤表层的酶活性［22］；其次植被退化以后，土壤失去植被保护而遭受侵蚀作用，在垂直剖面中加速了土壤有机质和养分的流失；最后随退化加剧，土层剖面的加深，土壤含水量与温度降低，水热条件的减弱致使土壤微生物的代谢产酶能力受到抑制［32］，因此垂直剖面中表层酶活性高于下层。土壤硝酸还原酶活性却随土层增加表现出增加的趋势，这可能是由于随土层深度的增加，土壤通透性逐渐降低，土壤中的好氧微生物消耗氧气，导致土壤含氧量下降，这在一定程度上反而刺激了适合低氧环境下反硝化细菌的生长繁殖，促使土壤硝酸还原酶活性升高［33］。由此可见，尕海湿地沼泽草甸退化与土层变化能够显著影响土壤中的微环境与氮素含量分布，进而使得土壤氮转化酶活性的空间分布存在差异，影响高寒生态系统土壤氮素循环转化过程。

3.2 土壤环境因子对土壤氮转化酶活性的影响

高寒湿地沼泽草甸退化能够引起土壤理化性质与养分含量等环境因子的改变［34］，是植被与土壤共同退化的作用。土壤酶活性与土壤环境关系密切［35］，许多研究表明土壤微环境状况（含水量、温度和pH等）、微生物活性和养分可利用性等是影响土壤酶活性变化的关键因素［36］。其中土壤理化因子可以通过调控土壤中一系列营养物质的转化速率［37］，以及通过改变土壤微生物的相关代谢活动，从而直接或间接地影响土壤酶活性及其稳定性［38］，进而影响土壤养分的转化与有效性。土壤含水量会通过影响催化反应底物浓度和酶自身的扩散与合成进而影响土壤酶活性。本研究中尕海湿地区沼泽草甸退化会造成地表土壤裸露程度增大，蓄水保水能力降低，导致土壤干燥，土壤酶的底物浓度水平发生变化，致使土壤氮转化酶活性发生相应改变，与黄海莉等［26］的研究结果一致。冗余分析结果表明，土壤含水量是尕海湿地区退化演替过程中土壤氮转化酶活性变化的主要驱动因子，沼泽草甸退化会造成区域内小生境的水热条件发生改变，土壤含水量不仅可以直接影响土壤微生物的生长和养分的有效性，还通过影响土壤的含氧量以及土壤淋溶作用等间接改变土壤酶活性大小［39］。土壤温度是影响土壤酶活性的重要环境因素之一，温度变化会促使土壤理化过程发生改变，从而影响分泌土壤酶的数量发生变化。本研究发现尕海湿地沼泽草甸退化过程中土壤温度与4种土壤氮转化酶活性均存在不同程度的正相关关系，这是由于绝大多数土壤酶为蛋白质物质，对温度变化较为敏感，升温提高了微生物的活性与其分泌酶的能力。由于高寒区域的土壤生物活动和酶活性长期受到低温限制［40］，随着温度的升高，区域的低温限制效应将会被打破，微生物的活性和分泌酶的能力进一步提高，土壤酶活性随之逐渐升高，这与Sharma等［41］研究发现高寒生态系统土壤酶活性随增温显著增加的结论相同。尕海湿地沼泽草甸退化程度的加剧以及土层的加深，土壤温度持续升高、土壤含水量逐渐降低，土壤微环境的水热条件发生变动，进而使得土壤氮素循环与分解利用的过程出现不同程度变化，又促使土壤氮转化酶活性随之发生响应变化。

土壤养分与土壤酶活性之间关系密切，土壤养分含量可以通过为微生物新陈代谢活动提供营养来源，其能够影响合成酶所需催化反应的底物浓度，进而影响土壤酶活性［42］。本研究也发现土壤氮转化酶活性与土壤氮组分含量存在不同程度的相关性，其中土壤有机氮在脲酶与蛋白酶等催化作用下转化为无机氮，无机氮被土壤微生物吸收后进一步转化成微生物生物量氮，微生物生物量氮又能够促使土壤氮素的固定，为土壤酶提供反应底物，而土壤硝酸还原酶能够把土壤中吸收的硝态氮转化为亚硝态氮，亚硝态氮再经亚硝酸还原酶的作用还原为铵态氮，进而构成一系列复杂的氮素循环过程，这在一定程度上表明土壤氮转化酶活性与土壤养分含量间既有拮抗作用，也有协同作用，存在一定的耦合关系［43］，每种土壤酶和特定的养分之间的相互关系因生境不同而异。综上，尕海湿地沼泽草甸退化改变了土壤水热环境与氮素含量水平，而处于高寒生态系统下的土壤环境变化对氮转化酶活性的影响是特殊且复杂的，促使土壤氮转化酶活性存在不同程度的响应改变，土壤氮转化过程也会发生变化，进而影响高寒沼泽草甸生态系统中土壤氮素的利用、积累与氮素转化速率。

4 结论

尕海湿地沼泽草甸退化加剧降低了土壤含水量、全氮、铵态氮和微生物生物量氮含量，增加了温度与硝态氮含量；同时也降低了土壤蛋白酶与亚硝酸还原酶活性，增加了土壤脲酶与硝酸还原酶活性。随土层深度的增加，土壤脲酶、蛋白酶、亚硝酸还原酶活性均显著下降，而硝酸还原酶活性仅在HD显著下降，退化程度和土层深度仅对土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性存在显著交互作用。冗余分析结果表明，土壤含水量是尕海湿地沼泽草甸退化演替过程中土壤氮转化酶活性变化最主要的驱动因素。由此可见，尕海湿地沼泽草甸退化能够影响土壤温湿度、氮组分含量与氮转化酶活性的变化，共同作用影响区域土壤氮素循环过程。