细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死大鼠发病中的作用

刘树义 李凯 兰凯 张旭东 王鹏 李瑜

(西安医学院 1临床医学院，陕西 西安 710021；2第二附属医院耳鼻咽喉科)

激素性股骨头缺血坏死(SANFH)是一种致残率较高的疾病，占非创伤性股骨头坏死发病的1/3以上〔1〕。近年来，临床治疗过程中，激素的大量使用导致SANFH发病率逐年增加，且病变多为双侧〔2〕。目前对SANFH的治疗仍以手术为主，尚无有效的非手术治疗措施。这一现状使其发病机制的研究十分关键。多年来，学者们对SANFH的发病机制做了大量研究，并取得了许多进展，形成了多种学说，包括脂质代谢紊乱、氧自由基损伤、微血管损伤及细胞凋亡与自噬等〔3〕，但截至目前仍无统一定论。细胞自噬是一种细胞应对与适应应激、损伤等恶劣环境、稳定内环境的自我保护机制。作为细胞程序性死亡的形式之一，它可以将受损的细胞器吞噬、降解〔4〕。在病理条件下，过度的自噬会促进正常组织细胞死亡。部分体外和在体实验研究均表明，激素对组织细胞的应激作用，使细胞的自噬被激活而产生自噬效应〔5〕，但在软骨细胞、骨细胞、破骨细胞中，所呈现的自噬效应却不尽相同〔6,7〕。本研究通过短期、大剂量使用糖皮质激素来构建SANFH大鼠模型，并分别应用自噬阻断剂和激活剂，分析各组大鼠骨头坏死情况及坏死股骨头组织内细胞自噬的水平，以明确细胞自噬在SANFH发病中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 主要试剂及药物：脂多糖(LPS，货号：L8880)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，货号：IM0190)、雷帕霉素(货号：R8140)购自北京索莱宝科技有限公司；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(40 mg/瓶)购自辉瑞制药有限公司；自噬效应蛋白(Beclin)1抗体(货号：A7353)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；微管相关蛋白/轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ抗体(货号：2775)、SQSTM1/p62抗体(货号：5114)购自Cell Signaling Technology,Inc.；β-actin抗体(货号：20536-1-AP)、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(货号：SA00001-2)购自武汉Proteintech公司；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液(货号：G1206、G1202、G1203)购自武汉谷歌生物科技有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色剂(货号：K5007)购自安捷伦(DAKO)科技公司；ClarityTM Western电化学发光(ECL)Substrate(货号：170-5060)购自Bio-Rad Laboratories,lnc.。主要仪器：脱水机(JJ-12J)、包埋机(JB-P5)购自武汉俊杰电子有限公司；ChemiDocTM XRS + Imaging System(1708265)、电泳槽(043BR70002)购自Bio-Rad Laboratories,lnc.；正置荧光显微镜(DM2000)购自Leica MICROSYSTEMS。

1.2SANFH大鼠模型的建立 自西安交通大学医学部实验动物中心〔动物合格证：SCXK(陕)2018-001〕购买24只SD雄性大鼠(250～300 g)，适应性饲养1 w后采用随机数字表法分为空白(C)组、模型(T1)组、模型+3-MA(T2)组及模型+RAP(T3)组，每组6只。T1、T2及T3组腹腔注射LPS(20 μg/kg)2次，每次间隔24 h；24 h后两侧臀肌交替注射甲泼尼龙(40 mg/kg)3次，每次间隔24 h〔8〕。T2、T3组每次肌肉注射甲泼尼龙前30 min，经腹腔分别注射3-MA(2.5 mg/kg)、雷帕霉素(1 mg/kg)。C组腹腔及臀肌注射生理盐水。药物注射结束继续饲养8 w后，将大鼠处死并取出双侧股骨头标本，测量坏死股骨头面积后，取少部分放入普通固定液中固定，剩余股骨头放入-80℃保存。

1.3股骨头坏死表面积测量 股骨头坏死表面积测量方法参考赵凤朝等〔9〕使用的坐标纸粘贴法。具体操作方法为：将坏死股骨头切成层厚为0.5 cm薄片，置于坐标纸上并描记其范围，采用Leica图像分析仪计算实际面积。

1.4免疫组织化学检测 将股骨头置于中性甲醛溶液固定72 h后，转移至30%甲酸溶液中继续脱钙72 h。脱钙完成后，使用梯度二甲苯、酒精进行脱水、透明，石蜡包埋后将组织块制成4 μm薄厚切片。组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，取出切片待自然冷却并进行数次洗涤后将切片放入3%过氧化氢溶液中室温孵育，25 min后使用3%牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。室温封闭30 min后，去除封闭液并加入LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62抗体溶液(1∶1 000)，将切片置于湿盒内4℃孵育过夜。切片经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min。PBS再次洗涤切片后，加入新鲜配制的DAB显色剂，在显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。显色终止后，使用Harris苏木素复染细胞核。流水冲洗后将切片置于梯度酒精和二甲苯溶液中进行脱水透明，自然晾干后使用中性树胶封片，并在显微镜下采集、分析图像。

1.5Western印迹检测 将股骨头组织称重后置于研钵中，加入适量液氮，快速将股骨头研磨为粉末状后转移至EP管中，按每20 mg组织加入250 ml RIPA裂解缓冲液(碧云天，P0013C)在冰上裂解，离心后提取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液后进行蛋白热变性。配置15%分离胶进行蛋白样品凝胶电泳，然后湿转至0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜。裁剪目的蛋白条带后使用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入β-actin(1∶1 000)、LC3Ⅱ/Ⅰ (1∶1 000)、p62(1∶500)及Beclin1(1∶1 000)抗体溶液，4℃孵育过夜。PBST洗膜3次×5 min后加入二抗(HRP标记)溶液，室温孵育1 h。PBST洗涤后，用新配制的ECL化学发光液浸湿蛋白条带并使用ChemiDocTM XRS + Imaging System进行成像。应用Image-Pro Plus 软件分析蛋白条带灰度值，评估目的蛋白的表达水平。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1股骨头坏死表面积测量 4组SD大鼠中，除C组股骨头无坏死外，T1、T2、T3均有不同程度的坏死，坏死率分别为83.33%、16.67%、100%，T3组股骨头坏死最为显著。T3组左右两侧的股骨头坏死面积明显大于T1和T2组(P<0.05)，且与T2组相比，T1组坏死面积更为显著(P<0.05)。见图1、表1。

图1 4组股骨头坏死情况

表1 4组股骨头坏死表面积比较

2.2免疫组织化学检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62及Beclin1蛋白表达 LC3Ⅱ/Ⅰ与Beclin1蛋白在T1、T2、T3组坏死股骨头组织中的表达量均多于C组。T3组上述蛋白表达多于T2、T1组，而T2组中上述蛋白的表达则低于T1组。p62蛋白在T3中表达量最少，T2组和C组表达量较高，且高于T1组。见图2。

图2 4组股骨头组织免疫组织化学检测(×100)

2.3Western印迹检测LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62及Beclin 1蛋白表达情况 LC3 Ⅱ/Ⅰ与Beclin 1蛋白在T1、T2、T3组坏死股骨头组织中的表达均明显多于C组(P<0.5)；T3组上述蛋白表达明显多于T2、T1组，而T2组上述蛋白表达则明显低于T1组(P<0.05)。4组p62蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表2。

图3 4组股骨头组织蛋白检测

表2 4组股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白及 P62蛋白相对表达量比较

3 讨 论

激素类药物是一类临床应用广泛且治疗效果显著的药物，但长期使用后的不良反应也较为严重。SANFH就是大量使用激素后诱发的一种致残率高且难治的疾病。长期以来，学者对SANFH的发病机制进行了大量研究，并阐述了其可能存在的发病机制。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，自噬被揭示在肿瘤、动脉粥样硬化等疾病发病中扮演了重要角色〔10,11〕。自噬作为真核细胞程序性死亡的形式(Ⅱ型程序性细胞死亡)之一，能够帮助机体清除无用的、破损的细胞器、有害大分子物质和病原微生物等〔12,13〕。然而，在一些致病因素的作用下，机体的自噬现象会显著增强，进而诱导组织细胞出现病理性死亡。研究发现，饥饿、缺氧、激素等均是诱发组织细胞产生自噬现象的常见因素〔14〕。Jia等〔5〕研究认为，糖皮质激素既能诱导骨细胞发生凋亡，又可诱导骨细胞发生自噬，且骨细胞由激素的剂量来决定。然而，Lai等〔7〕在牙周炎动物模型中发现，辛伐他汀能够通过增强自噬而呈现出成骨细胞保护效应。部分关于激素诱导的细胞自噬与骨量及骨质疏松关系的研究也存在着争论〔15,16〕。可见自噬与骨细胞、成骨细胞及破骨细胞的关系仍未明确，还需进一步探索。

本研究结果证实，短期、大剂量使用激素能够诱发股骨头坏死，同时也提示SANFH的发生很可能与体内细胞自噬水平的高低密切相关。Gao等〔17〕在体外实验研究中也发现地塞米松通过抑制蛋白激酶B(Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)C1信号通路而促进细胞自噬，并损伤骨细胞。研究表明，LC3在一定程度上能够体现细胞自噬体的数量，是自噬的标志性分子，而LC3 Ⅱ/Ⅰ则是评价细胞自噬水平可靠的指标〔18〕。本研究结果进一步证实了自噬参与了SANFH的发病。Beclin1是最早被发现的自噬调控基因，其在各组股骨头组织中的表达趋势与LC3一致，提示激素诱发股骨头坏可能是通过Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(Class Ⅲ PI3K)/Beclin 1通路，调控自噬体的形成，进而促进骨组织细胞发生自噬性死亡。研究认为，p62蛋白通过结构域能够同时与LC3、泛素化蛋白相结合，介导泛素化蛋白的自噬性降解，具有指示自噬底物降解程度和自噬活性的价值〔19〕。本研究中p62蛋白的变化与自噬的启动、抑制及促进有关，提示抑制自噬在一定程度上能减少股骨头坏死发生的概率。

综上，SANFH作为激素药物的不良反应之一，其发病机制较为复杂。短期、大剂量使用激素，能够通过促进细胞发生过度自噬性死亡，进而使得股骨头出现局部骨量丢失、骨质疏松及塌陷。但本研究未就自噬导致SANFH的具体机制进行探究，以后研究应在此基础上进一步探索。