微量热法研究MB/TiO2复合物对白色念珠菌的抑制行为

王智俊，刘东亮，付娌丽，饶 璐，李月生

(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100;2.湖北科技学院辐射化学与功能材料湖北省重点实验室，湖北咸宁 437100;3.湖北省智慧康养产业技术研究院，湖北咸宁 437100)

0 引言

生物体内的化学反应一般在等温状态条件下进行，热效应较小.如若能够使用某种方法测量出生物体内化学反应所产生的热效应，那就能对生物系统进行静态(恒温式)的连续跟踪检测.微量热法是一种高灵敏度和高精准度的技术，是一种适合定性和定量研究生物活性的技术，是一种基于自动、连续监测变化过程的热效应而建立的热化学方法.该技术已广泛应用于药物与生物相互作用的研究.可通过分析生长代谢热功率输出曲线而得到生物机体生理活动的热力学和动力学信息[1].实际上，微量热法非常适合于测量轻微放热或吸热过程的热输出，如微生物细胞、细胞器、组织的产热器官.近年来，微量热法已广泛应用于药物和微生物细胞之间的相互作用[2].

亚甲基蓝(MB，别名：碱性湖蓝；次甲基蓝；美蓝，化学式为C16H18N3ClS)在抗菌领域的应用十分广泛.Jian Ji团队[3]基于MB和β-环糊精之间的主客体相互作用，开发了一种具有很大潜力的抑菌涂层，具有广泛的应用场景，如医疗设备杀菌的替代品.Busi Siddhardha团队[4]使用MB和Ag NPs的混合物，发现具有更高的抗菌活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都更有效.此外，K Kholikov团队[5]使用MB与石墨烯量子点(GQD)结合，可增强单线态氧的产生，从而提高细菌灭活率，以增强抗菌活性.

纳米二氧化钛由于其化学稳定性、生物相容性和抗菌性能，已成为抗菌材料领域的热点之一.Sara Akhtar团队[6]合成了纳米TiO2胶体，对革兰氏阳性和阴性致病菌进行了抑菌试验，试验结果表明TiO2纳米胶体具有抗菌潜力.Yue-Sheng Li团队[7]以聚乙烯醇(PVA)、羧甲基壳聚糖(CMCS)和纳米TiO2为原料，通过冻融循环和电子束辐射制备了纳米TiO2/CMCS/PVA三元纳米复合水凝胶，具有显著的抑菌活性.Seyed Mohammad Davachi团队[8]采用壳聚糖/二氧化钛纳米复合材料制备了超疏水棉织物，发现纳米复合涂层织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能,所研制的纳米复合涂层织物在抗菌方面具有广阔的应用前景.

在全球范围内真菌感染是传染病导致死亡的一个最主要的原因.而念珠菌是侵袭性真菌感染最常见的原因之一，其中白色念珠菌又是侵袭性念珠菌病的主要原因[9].白色念珠菌在临床上是一种重要的人体致病真菌，通常存在于人口腔、下呼吸道、肠道及阴道，一般可与宿主共生，不引起疾病，而当宿主免疫功能异常或正常菌群失调时就会引发急性、亚急性或慢性感染[10].

本文采用微量热法，研究了MB/TiO2复合物对白色念珠菌的热功率输出曲线，直接测定白色念珠菌在MB/TiO2复合物作用下的生长代谢过程，并根据热功率输出曲线计算白色念珠菌在MB/TiO2复合物作用下的生长速率常数、传代时间、抑制率、半抑制浓度等热动力学参数，进一步揭示了白色念珠菌生长代谢过程的热动力学规律.

1 实验部分

1.1 实验样品及仪器

1.1.1仪器 LKB-2277生物活性检测系统(瑞典)，热稳定性好，可稳定在±1×10-4℃，恒温工作范围在20～80 ℃，热功率最小检测极限为0.12 μW，24 h内基线漂移为0.2 μW，实验时系统控温于37.00 ℃；X射线衍射分析仪(XRD-600，日本岛津)；扫描电镜(VEGA 3 SBH，TESCAN公司，捷克).

1.1.2材料 TiO2(Degussa P-25,Germany)；MB(Sigma,St.Louis,MO,USA)；白色念珠菌(ATCC 64550)；培养基(营养肉汁培养基)：取NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.6 g，溶于100 mL二次蒸馏水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高压灭菌30 min，冰箱中放置备用；LB(Luria-Bertani)培养基：取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，溶于1000 mL二次蒸馏水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高压灭菌30 min，冰箱中放置备用.

1.2 MB/TiO2复合物的制备

根据文献[11-12]，在pH为7.4±0.1的PBS缓冲溶液中制备MB/TiO2纳米复合悬浮液，静置8 h后，离心，干燥，即得MB/TiO2复合物.所有溶液均用双蒸馏水配制，样品质量在微天平上精确称重.

1.3 实验方法

用X射线衍射分析仪(XRD)和扫描电镜(SEM)分析MB/TiO2复合物样品的结合情况.

使用停流法进行检测.检测前先用0.1 mol·L-1NaOH溶液清洗管道和流通池，再用0.1 mol·L-1HCl溶液清洗，接着使用体积分数为75%的乙醇溶液清洗，最后使用无菌水清洗管道和流通池.待基线稳定之后，用蠕动泵以50 mL·h-1的流速将菌液和样品的混合液泵入生物活性检测系统中，当样品充满流通池(约0.6 mL)后停泵，记录仪自动跟踪记录流通池内细菌的生长代谢热功率输出曲线(P-T曲线)，当记录笔返回基线后，实验结束.

TiO2和MB/TiO2复合物按实验要求用二次蒸馏水配制成溶液，实验前先将细菌接种于5 mL的新鲜的LB培养基中，接种量为106cfu/mL，后将用二次蒸馏水溶解后的待测样品加入LB培养基中，在振荡器上摇匀.整个操作过程均在超净工作台里进行.

2 结果与讨论

2.1 样品的表征

2.1.1 X射线衍射(XRD)分析 将TiO2、MB以及合成的MB/TiO2复合物研磨、压片，用X射线衍射分析仪进行分析.如图1所示，在25.2°、38.6°、53.9°、55.1°处出现了TiO2的特征峰，说明MB的复合没有改变TiO2的晶型结构.

2.1.2 扫描电镜(SEM)分析 通过SEM对MB/TiO2复合物的表面形貌进行观察与分析.如图2(a.b)所示，TiO2存在明显的聚集现象，如图2(c.d)所示，发现MB已附着在TiO2表面，与之结合，同时可以看出MB/TiO2复合物比单一的TiO2具有更好的分散性.

图1 MB、TiO2、MB/TiO2复合物的XRD分析Fig.1 XRD analysis of MB, TiO2 and MB/TiO2 composites图2 TiO2的SEM分析(a,b);MB/TiO2复合物的SEM分析(c,d)Fig.2 SEM analysis of TiO2(a,b);SEM analysis of MB/TiO2 composites(c,d)

2.2 白色念珠菌生长代谢热功率输出曲线

近似生理条件下,用停流法测定了白色念珠菌生长代谢热功率输出曲线(P-T)，如图3所示.生长代谢热功率输出曲线与传统生物学方法所获得的典型细菌生长曲线结果能很好的吻合，也包括四个主要时期：停滞期(I)、指数生长期(II)、非指数生长期(III)、衰亡期(IV).

图3 白色念珠菌的生长代谢热功率输出曲线Fig.3 The power-time curves of Candida albicans growth

同时测定了TiO2和MB/TiO2复合物作用下的白色念珠菌的生长代谢的热功率输出曲线，图4a为白色念珠菌在不同浓度的TiO2作用下的生长代谢的热功率输出曲线.随着浓度的增加白色念珠菌的停滞期变长，生长期的最大产热功率(Pm)减小.在相同的实验条件下，其结果有非常好的重现性.

图4b反映了白色念珠菌在不同浓度MB/TiO2复合物作用下生长代谢热功率输出曲线情况.将白色念珠菌在TiO2样品和MB/TiO2复合物的热功率输出曲线进行比较，可以看到白色念珠菌在MB/TiO2复合物作用下，传代时间tG延长，生长代谢热功率输出曲线上的停滞期变长，生长峰后移，生长期的最大产热功率Pm减小，而且这个趋势随着MB/TiO2复合物浓度的逐渐增大，变化会愈加明显，表面MB/TiO2复合物对白色念珠菌的生长代谢的抑制作用且比单独使用TiO2效果更好.

图4 白色念珠菌在不同浓度的TiO2作用下的生长代谢热功率输出曲线(a);白色念珠菌在不同浓度的MB/TiO2复合物作用下的生长代谢热功率输出曲线(b)Fig.4 The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of TiO2 at different concentrations(a);The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.3 白色念珠菌的生长速率常数k和传代时间tG的计算

在细胞的指数生长期中，产热功率Pt与生长速率常数k之间有如下关系[13]：

Pt=P0exp(kt)或LnPt=LnP0+kt

(1)

将生长代谢热功率输出曲线上指数生长期的Pt，t值代入式(1)中，用计算机进行线性拟合分别得到白色念珠菌在TiO2和MB/TiO2复合物作用下生长速率常数k.

另外，传代时间tG与生长速率常数k之间有如下关系：

tG=(ln2)/k

(2)

通过式(2)可以得到白色念珠菌在不同浓度的TiO2和MB/TiO2复合物样品作用下的传代时间tG(如表1所示).表1显示白色念珠菌的生长速率常数k随着TiO2和MB/TiO2复合物样品浓度的增加而减小，细胞的传代时间tG相应延长.

2.4 生长速率常数k与浓度c的关系

由表1可以得到生长速率常数k随着MB/TiO2复合物和TiO2样品浓度c的增大而减小，表明MB/TiO2复合物和TiO2样品对细菌均产生较大影响.TiO2样品浓度较低时，生长速率常数k随着药物浓度的增大而显著下降；而浓度较高时，随着样品浓度的逐渐增大，生长速率常数k下降速度逐渐减缓.而MB/TiO2复合物则没有这种趋势，可见对于TiO2和MB/TiO2复合物，白色念珠菌的生长速率常数k随样品浓度的变化不完全相同，说明TiO2和MB/TiO2复合物对白色念珠菌的生长代谢过程的影响也不完全一样，也许是因为它们的结构导致与微生物中酶的结合各不相同，从而使它们对微生物生长代谢过程的作用不同.

以k对c进行线性拟合，则得k与各样品浓度c的关系分别为:

TiO2k=0.911 3-0.001 4c+9.313 0×10-7c2R2=0.956 5

MB/TiO2k=0.982 65-6.777 06cR2=0.867 7

表1 白色念珠菌在不同浓度MB/TiO2复合物和TiO2作用下的热动力学参数Tab.1 Thermokinetic parameters of Candida albicans in the presence of MB/TiO2 complexes and TiO2 at different concentrations

通过k-c图形可以更直观的看到，随着样品浓度的增加，细菌的生长受到的抑制越大，由方程tG=(ln2)/k得到的传代时间tG也逐渐增加.如图5a和图5b所示.

图5 白色念珠菌在不同浓度的TiO2作用下的生长速率常数k(a);b:白色念珠菌在不同浓度的MB/TiO2复合物作用下的生长速率常数k(b)Fig.5 The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a);The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.5 抑制率I和半抑制浓度IC50

样品对白色念珠菌的抑制率可通过下面公式得到：

I=[(k0-kC)/k0]×100%

(3)

式中k0为细胞未受到抑制时生长速率常数，kC为细胞受到浓度为c的样品抑制作用时的生长速率常数.半抑制浓度IC50为抑制率为50%时所对应的样品浓度.根据式(3)，得出了白色念珠菌在MB/TiO2复合物和TiO2样品不同浓度作用下的抑制率I及半抑制浓度IC50，结果如表1所示.半抑制浓度IC50体现细菌被样品抑制的敏感性：IC50值越小，表示细菌对样品越敏感，也就是样品的抑制作用就越大.由表1可得出：白色念珠菌对MB/TiO2复合物最敏感，对TiO2敏感的程度其次.

2.6 抑制率I与浓度c的关系

由表1可以得到抑制率I与样品浓度c的关系，抑制率I随样品浓度的不断增加而增加，说明样品浓度越高，对白色念珠菌的抑制作用越强，当抑制率为100%时说明大肠杆菌被完全抑制，二者线性拟合方程为：

TiO2I=0.064 04+5.945 29cR2=0.927 59

MB/TiO2I=-0.077 54+6.777cR2=0.931 49

通过I-c图形(图6a和6b)可以很直观的看到，随着样品浓度的增加，细菌生长所受到的抑制越大.

2.7 MB/TiO2复合物抑制白色念珠菌生长代谢的机理

MB/TiO2复合物比单一的TiO2具有更好的分散性和晶体特性.而白色念珠菌细胞膜上存在数个作用位点，MB/TiO2复合物因其更佳的分散性和晶体特性，更易与白色念珠菌细胞膜上的多个位点发生相互作用[14]，导致白色念珠菌细胞膜破损，从而导致细胞内的细胞质外泄，最终导致细菌死亡.而TiO2因其出现的聚集现象，不易与白色念珠菌上的多个作用位点同时结合，抑制白色念珠菌生长代谢的效果自然不如MB/TiO2复合物.MB/TiO2复合物导致白色念珠菌细胞膜破损，也进一步验证了纳米粒子与生物体细胞膜相互作用的观点[15].

图6 白色念珠菌在不同浓度的TiO2作用下的抑制率I(a);白色念珠菌在不同浓度的MB/TiO2复合物作用下的抑制率I(b)Fig.6 The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a); The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

3 结论

在近似生理条件下，采用微量热法研究MB/TiO2复合物对白色念珠菌的抑制行为，并与TiO2对白色念珠菌的抑制进行对比.实验结果表明：首先，MB/TiO2复合物对白色念珠菌的抑制效果强于TiO2.其次，MB/TiO2复合物的生长速率常数(k)和最大产热功率(Pm)随着其浓度的增加而下降，而传代时间(tG)和抑制率(I)随着其浓度的增加而增加.MB/TiO2复合物的生长速率常数(k)和抑制率(I)均与其浓度成一定的线性关系.

总之，这项工作表明微量热法可以为纳米复合材料对细菌的抑菌作用的研究提供一个很好的，且不能用常规方法获得各项动态信息的方法，解决了当前分析纳米生物技术难的问题.这项工作有效提供了研究纳米材料作为抗菌，抗病毒和污染控制的新平台.