长链非编码RNA GAS5 在缺血性脑卒中及相关疾病中的研究进展

杨梅柳 虞武 解燕昭 赵景茹 董立朋 陈彦霞

1 衡水学院生命科学学院 河北省衡水市 053000

2 衡水学院校医院 河北省衡水市 053000

3 河北省人民医院神经内科 河北省石家庄市 050000

4 河北医科大学第二医院内分泌科 河北省石家庄市 050000

缺血性脑卒中是全世界致残、致死的主要原因之一[1]，脑组织血流中断后缺血缺氧导致神经功能受损，脑梗死后遗留的偏瘫、失语、认知障碍等症状给家庭和社会带来沉重的负担，虽然目前预防和治疗缺血性脑卒中的方法取得了重大进展，但效果仍然欠佳，因此对脑梗死发病机制的深入研究迫在眉睫。缺血性脑卒中病理过程复杂，主要包括动脉粥样硬化作用下内皮功能障碍和微血管壁的改变[2]，涉及炎症、氧化应激、血脑屏障功能障碍、脑水肿及神经元凋亡等一系列病理分子过程[3]，长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）参与了多个过程[4]，lncRNA 是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，是近年来研究比较深入的RNA 分子之一，在细胞的凋亡、细胞周期、增殖、细胞分化等生物过程中发挥调控作用[5]，越来越多的研究证实lncRNA 在缺血性脑卒中发病机制中也发挥重要功能。尽管lncRNA 在缺血性脑卒中的研究有限，但预测lncRNA 在缺血性脑卒中的诊断及治疗方面有很大的潜力，lncRNA 可能成为诊治缺血性脑损伤的关键分子靶点。

生长阻滞特异性转录因子5（growth arrest-special transcript 5,GAS5）位于人类基因组1 号染色体上，在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物过程中起重要调控作用，最初是通过筛选潜在的肿瘤抑制基因而命名，与多种肿瘤发生发展密切相关[6-7]，近年来发现其参与缺血性脑卒中的病理过程，并可通过不同的信号通路参与高血压与动脉粥样硬化的形成。

lncRNA GAS5 与缺血性脑卒中

lncRNA GAS5 通过募集DNA 甲基转移酶3B（DNA methyltransferase 3B,DNMT3B）显著诱导丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 4,MAP4K4）甲基化并下调MAP4K4 表达，增加脑梗死体积，抑制lncRNA GAS5 表达可减轻小鼠中脑动脉栓塞模型的脑梗死、神经损伤、细胞凋亡和炎症损伤。在细胞实验中，lncRNA GAS5 促进氧糖剥夺条件下神经元的凋亡，上调促凋亡基因Bax，下调抗凋亡基因Bcl-2[8-11]表达，siRNA 沉默lncRNA GAS5 表达可抑制caspase-3的激活，降低Bax 表达，增加Bcl-2 表达水平显著抑制神经元凋亡，提高氧糖剥夺下细胞活力，改善缺血性卒中的神经功能[12]。lncRNA 与miRNA 密切相关，lncRNA 可通过不同的miRNA 调控不同传导通路发挥作用。研究显示中脑动脉栓塞术后和氧糖剥夺处理的小鼠初级脑神经元中lncRNA GAS5 水平与miR-137 表达呈负相关，lncRNA GAS5 作为miR-137 的竞争内源性RNA（ceRNA），通过抑制Notch1 信号通路，调节内源性靶标Notch1 降低神经元存活率[9]，lncRNA GAS5 可通过竞争性海绵miR-9，促进FOXO3 的表达，下调lncRNA GAS5 可调控miR-9/FOXO3，从而缓解神经元细胞损伤[10]，lncRNA GAS5 也可通过海绵miR-221 调控PUMA和下游JNK/H2AX 信号通路，加速细胞凋亡[13]。lncRNA GAS5 还可通过竞争性结合miR-365a-3p 调控DCDC2 的表达，从而形成GAS5/miR-365a-3p/DCDC2调控网络[11]。由此推测lncRNA GAS5 通过不同的通路在缺血性脑卒中发病过程中起调控作用。

缺血再灌注损伤是缺血性卒中常见的并发症之一，缺血再灌注损伤后大鼠lncRNA GAS5 表达升高，siRNA 敲低lncRNA GAS5 可以逆转缺血再灌注诱导的细胞凋亡和炎症反应。生物信息学分析表明，lncRNA GAS5 竞争性地吸附了miR-26b-5p，过表达的miR-26b-5p 可通过抑制靶点Smad1 表达改善细胞凋亡及炎症反应[14]。应用氧糖剥夺再氧化诱导大鼠原代星形胶质细胞观察发现，沉默lncRNA GAS5还可通过miR-1192/STAT5A 轴抑制AQP4 表达缓解脑缺血再灌注损伤[15]。研究发现lncRNA GAS5 和STAT5A 在脑卒中患者中表达较强，抑制模型大鼠lncRNA GAS5 或STAT5A 可改善神经功能，减少梗死和神经元凋亡，降低脑含水量和星形胶质细胞活化，机制可能为lncRNA GAS5 可靶向调控miR-1192，沉默lncRNA GAS5 后miR-1192 表达被抑制，星形胶质细胞的增殖受到干扰，凋亡和炎症增强，沉默STAT5A 后可逆转这一现象，STAT5A 可能与AQP4启动子结合并调控其表达而发挥作用，与单独沉默lncRNA GAS5 相比，沉默lncRNA GAS5 和过表达AQP4 导致上述现象更加明显。

临床研究显示，急性缺血性脑卒中患者较健康者的lncRNA GAS5 表达增高，并且与患者的NIHSS评分和促炎细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-17A 表达呈正相关，与抗炎细胞因子IL-10 呈负相关，机制可能是lncRNA GAS5 通过调节患者的Smad1 来加速炎症反应，通过调节巨噬细胞和血管内皮细胞凋亡促进血管内膜增厚，加重动脉粥样硬化病变，从而增加急性缺血性脑卒中的严重程度，还可能通过Notch1 信号通路调控神经元凋亡，加速血栓形成，加重脑缺血损伤，进而引起认知功能损伤，加重病情[16]，因此推测lncRNA GAS5 是急性缺血性脑卒中的一个潜在预测指标。

进一步探讨中国汉族人群中两种功能lncRNA GAS5 变异（rs145204276 和rs55829688） 与脑卒中易感性之间的相关性，Deng 等[17]采用改进的多温连接酶检测反应（iMLDR-TM）基因分型技术，对1 086 例缺血性脑卒中患者和1 045 例年龄匹配的健康对照组的lncRNA GAS5 变异进行基因分型，发现脑卒中患者与健康者相比，rs145204276 等位基因和基因型频率有很大变化，del-T 单倍型在脑卒中病例中更为普遍。根据环境因素进行分层发现rs145204276 del 等位基因在男性、吸烟者、高血压患者和≥65岁的人群中与缺血性脑卒中高风险相关，对亚型进行分享，发现携带rs145204276 del 等位基因的个体患动脉粥样硬化性脑卒中的几率更大。此外，在缺血性脑卒中患者中，rs145204276 del 等位基因与lncRNA GAS5 表达升高之间存在显著相关性。Zheng 等[18]对509 例缺血性脑卒中患者和668 名健康对照者进行基因分型，频率与年龄、性别、居住地区和种族相匹配，logistic 回归分析的结果确定rs145204276 del/del 基因型为缺血性脑卒中的危险因素，携带rs145204276 del/del 基因型的患者lncRNA GAS5 水平显著升高，转染rs145204276 del 等位基因的细胞荧光素酶活性显著增加，表明rs145204276 del等位基因通过提高转录活性，进而增强lncRNA GAS5表达，并且与缺血性脑卒中易感性增加存在显著关联。

中药制剂对缺血性脑卒中的治疗有较大收益，清大颗粒可通过降低脑缺血再灌注损伤大鼠和氧糖剥夺再氧化损伤HT22 细胞中的lncRNA GAS5、Bax 和cleaved caspase3 的表达，增加了miR-137 和Bcl-2 的表达，显著改善大鼠的脑组织损伤，减少神经元损失，促进损伤HT22 细胞生长，抑制细胞凋亡[19]，总之清大颗粒可能是通过lncRNA GAS5/miR-137 信号通路在缺血性脑卒中发挥神经保护作用。另一项研究显示姜黄素也可通过抑制大鼠神经元细胞和脑组织中lncRNA GAS5 表达保护脑细胞，过表达lncRNA GAS5 可降低细胞活性，促进凋亡，而姜黄素和低表达的lncRNA GAS5 可以增强细胞活性，降低细胞凋亡，机制可能是姜黄素通过抑制lncRNA GAS5 从而抑制炎症相关因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达，最终减轻脑缺血细胞损伤[20]。姜黄素还有抵抗卒中后抑郁的作用，在卒中后抑郁大鼠模型应用姜黄素后，通过开放旷场试验和悬尾试验以及检测血清中皮质酮、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）水平、海马中神经递质5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）水平显示，模型大鼠抑郁症明显减轻，可能的机制为姜黄素通过增强的lncRNA GAS5 表达激活BDNF/Trkβ 信号通路，促进突触相关蛋白的表达[21]。上述研究发现可能由于模型及检测指标不同，lncRNA GAS5 会有不同的作用，但是总体来说，其在缺血性脑卒中发病及发展中起到重要作用。

lncRNA GAS5 与高血压

高血压是缺血性脑卒中的重要危险因素，发病机制是基于内皮细胞失调、血管平滑肌细胞功能障碍、血管生成受损等病理改变[22-23]。研究表明lncRNA GAS5 是参与高血压和血管重塑发病机制最多的lncRNA 之一[24-25]，lncRNA GAS5 在正常大鼠和自发高血压大鼠视网膜、尾动脉、肾动脉、胸主动脉和颈动脉中均有表达，与非高血压大鼠相比，自发高血压大鼠各组织及血浆中lncRNA GAS5 表达明显下调，lncRNA GAS5 在高血压患者血浆中的水平也低于正常人。高血压可导致大鼠视网膜中出现新生血管及毛细血管渗漏，敲低lncRNA GAS5将导致新生血管数量进一步增加、加剧毛细血管变性、毛细血管渗漏，加重碱性烧伤诱导的血管生成，促进高血压期间小血管的重构。使用siRNA 下调lncRNA GAS5 表达，可增加人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖能力，加速细胞迁移及管状形成，减少H2O2诱导的细胞凋亡，增强细胞活力及抗氧化应激能力[25]。

一项临床研究发现，与健康对照组相比，高血压患者lncRNAGAS5 表达水平降低，当lncRNAGAS5 表达变化0.38 倍时，可预测无症状器官损害，敏感性86.6%，特异性88.7%，lncRNAGAS5 表达降低可导致无症状器官损害的风险增加，可作为高血压患者无症状器官损害的独立预测因子[26]。

Ali 等[27]研究发现，与正常对照组相比，高血压合并脑卒中组患者和非高血压脑卒中组患者血清中lncRNA GAS5 水平均显著降低，其中伴有高血压者的血清lncRNA GAS5 水平降低更加明显，且lncRNA GAS5 水平与患者NIHSS 评分呈显著负相关，lncRNA GAS5 的ROC 曲线分析能够区分脑卒中伴高血压患者与脑卒中非高血压患者，因此认为lncRNA GAS5 可作为脑卒中后病情严重程度和预后的生物标志物，为脑卒中治疗提供新的靶点。

lncRNA GAS5 与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是导致脑卒中的重要原因之一，动脉内粥样斑块因炎症、脂代谢异常等导致斑块破损，血栓形成及脱落，堵塞动脉引起缺血性脑卒中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）参与了动脉粥样硬化的形成，其诱导的血管内皮损伤是动脉粥样硬化的早期发病机制之一[28]，从患者和动物模型中收集的动脉粥样硬化斑块中，lncRNA GAS5 表达显著增加，下调lncRNA GAS5 的表达减少了ox-LDL 处理的THP-1 细胞凋亡，lncRNA GAS5 过表达可显著提高ox-LDL 刺激后THP-1 细胞凋亡，在ox-LDL刺激后THP-1 细胞衍生的外泌体中也存在lncRNA GAS5，lncRNA GAS5 可通过外泌体调控巨噬细胞和内皮细胞的凋亡，推测lncRNA GAS5 可能是参与动脉粥样硬化病理生理过程的靶分子[29]。经ox-LDL诱导的HUVEC 细胞损伤中lncRNA GAS5 水平明显增高，miR-29a-3p 下调，pcDNA-GAS5 致lncRNA GAS5 过表达的HUVEC 细胞活力明显降低，凋亡增加，高剂量杨梅素干预可抑制pcDNA-GAS5 导致的lncRNA GAS5 过表达，通过抗炎、抗氧化起到保护细胞的功能[30]，lncRNA GAS5 敲低可促进胆固醇的逆向运输并抑制细胞内脂质积累，最终通过减少zeste 同源物2 的增强子（EZH2）介导的组蛋白甲基化对ATP 结合盒转运体A1（ABCA1）的转录抑制来阻止动脉粥样硬化的进展[31]，这些都提示抑制lncRNA GAS5 可能是治疗动脉粥样硬化的有效途径。

综上所述，lncRNA GAS5 参与缺血性脑卒中的病理过程，虽然研究还比较局限，但也提示lncRNA GAS5 有可能成为缺血性脑卒中新的治疗靶点[32]。