microRNA在玉米生长发育及非生物胁迫响应中的调控功能*

潘锦康 李晶** 刘琳

（1）深圳大学生命与海洋科学学院，广东省植物表观遗传学重点实验室，深圳 518060；2）深圳大学龙华生物产业创新研究院，深圳 518060）

microRNA（miRNA）是一类长度为20～24 nt的内源非编码小RNA，它们在真核生物的转录后调控过程中发挥着重要的作用［1］。植物中，miRNA由MIR基因编码，经RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）转录产生包含不完全配对茎环结构、长的单链初级转录本primary-miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA 具有5′端7-甲基鸟苷帽子（m7G-cap）和3′端多聚腺苷酸尾（polyA tail），经Dicer-like 1（DCL1）核酸内切酶切割产生带有茎环结构的前体precursor-miRNA（pre-miRNA）。DCL1 在 HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）、SERRATE（SE）等因子的辅助作用下进行精确切割，产生miRNA/miRNA*双链二聚体，随后该双链二聚体的3′端被HUA ENHANCER1（HEN1）甲基化从而保护其不被尿苷化而降解。成熟miRNA 链进一步被加载到包含ARGONAUTE（AGO）蛋白的RNA 诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC），通过与靶基因mRNA 序列发生互补配对进行剪切或者翻译抑制，从而在转录后水平调控靶基因的表达（图1）［1］。植物miRNA的靶基因包含大量调节多种生物学过程的转录因子，通过对靶基因的调控，miRNA 广泛参与植物生长发育和逆境胁迫响应等多个重要生物学过程，包括顶端分生组织的形成、叶片极性的建立、开花时间调控、侧根的发育，以及干旱、高盐、高温等逆境胁迫响应［2-5］。多项研究表明，miRNA在重要作物的性状改良方面也发挥着重要功能，可以作为有效的基因资源精确调控作物多方面的农艺性状，对作物性状改良和分子育种具有重要价值［6-7］。

玉米不仅是重要的粮食作物，也是主要的饲料和工业原料，在国民经济生活中占据重要地位。近年来，中国玉米总消费量持续上涨，提高玉米的产量和品质对于保证国家玉米产业的稳定发展、满足国内日益增长的消费需求具有重要意义。miRNA在玉米的生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的调控作用，理解miRNA 的分子作用机制及下游调控网络将为玉米关键农艺性状的遗传改良提供理论依据。本文综述了近年来关于玉米miRNA 的鉴定、miRNA生物发生途径的核心组分以及miRNA在玉米生长发育和非生物胁迫响应方面的研究进展，并讨论了玉米miRNA 研究领域当前存在的主要问题和未来发展趋势。

Fig.1 Biogenesis and mode of action of miRNA图1 miRNA的生物发生及作用方式

1 玉米miRNA的发现与鉴定

自首次在模式植物拟南芥中发现miRNA 以来［8-9］，新的miRNA在其他植物物种中陆续得到鉴定，如水稻、大豆、小麦等［10-13］。玉米中首先鉴定的miRNA 为miR166 和miR172，通过功能研究发现它们分别在调控叶片极性和营养生长的时相转换中发挥关键作用［14-15］。早期大规模玉米miRNA的鉴定主要是通过和已知miRNA 进行序列和结构比对，从而对物种间保守的miRNA进行预测［15-16］。随着高通量测序技术的发展，对miRNA 的鉴定逐渐转变为利用建立小RNA 文库结合高通量测序分析的方法，从而更为系统和有效地获得真实表达的miRNA，同时也能鉴定在玉米中特异表达的非保守miRNA［17］。玉米中MIR基因的分布模式与一般的蛋白质编码基因类似，广泛存在于多条染色体上，其中一部分MIR同源基因具有成簇存在的现象［17］。与其他植物物种一致，大部分玉米MIR基因存在于基因间区域［17］。利用玉米不同发育时期的特定组织，通过构建小RNA 文库进行高通量测序分析，发现大量组织、时空特异性表达的miRNA，如在玉米叶与根［18］、茎［19］、雌穗［20］和籽粒［15，21］中特异表达的miRNA。此外，通过对玉米进行不同的逆境胁迫处理，鉴定出一系列参与特定胁迫过程的miRNA，包括干旱胁迫［22-23］、盐胁迫［24］、高温胁迫［25］、冷胁迫［26］、营养胁迫［27］和生物胁迫等［28-29］。上述研究鉴定获得的大量miRNA，丰富和完善了玉米的miRNA 数据库。目前，根据miRBase的注释，在玉米基因组中共鉴定到来自174个前体的325个成熟miRNA，分属于29个miRNA家族［30-31］。

2 玉米中miRNA生物发生途径的核心组分

2.1 DCL核酸内切酶

Dicer 蛋白是一个RNase III类核酸内切酶，负责将长的双链RNA切割成带有3′端2 nt突出和5′单磷酸的双链小RNA。动物的Dicer 蛋白和植物的DCL蛋白具有保守的DExD框（DExD-box）、解旋酶C（helicase-C）、DUF283、PIWI/ARGONAUTE/ZWILLE（PAZ）、RNase III和双链RNA结合（dsRBD）结构域［32］。玉米具有5个DCL家族成员，分别为ZmDCL1、ZmDCL2、ZmDCL3a、ZmDCL3b 和ZmDCL4［33］。这些DCL基因分别存在于1、3、5、10 号染色体（图2，表1），其编码蛋白质分属DCL1、DCL2、DCL3、DCL4 家族，其中ZmDCL3a和ZmDCL3b同属于DCL3家族（图3a）。对多个玉米DCL 家族成员突变体的研究表明，DCL 蛋白对于植株的生长发育具有重要功能［34-36］。其中DCL1 在miRNA 的生物发生过程中发挥调控作用。fuzzy tassel（fzt）是玉米ZmDCL1基因的突变体，fzt表现出多方面的发育缺陷，包括植株矮化、叶片形态和极性改变、幼年期向成年期转变推迟、雌雄花序发育缺陷、性别决定改变等［34］。fzt突变体中大部分miRNA 表达水平降低，这与DCL1 影响miRNA 加工的功能是相关的［34，37］。玉米中另一个研究较为清楚的DCL成员是ZmDCL4。玉米dcl4突变体的叶片极性发生改变，其极性改变程度随玉米自交系背景的不同而有差异［36］。玉米不同DCL 之间功能可能发生替代，在dcl4缺失突变体中，DCL2/3 能够代替DCL4 切割TAS3产生22 nttasiR-ARF，发挥调控生长发育和抗病的作用［36］。DCL3b 是单子叶植物特异的DCL，负责产生24 nt 相位小干扰RNA（phased small-interfering RNA，phasiRNA），主要在减数分裂的花药中表达。玉米dcl3b突变体中几乎没有24 nt phasiRNA 产生，表现出花药短、绒毡层细胞缺陷和温度敏感的雄性不育表型，这些结果说明DCL3b对玉米雄穗的发育至关重要［35］。

Fig.2 Distribution of maize DCL,AGO and HEN1 gene family members on chromosomes图2 玉米DCL、AGO、HEN1基因家族成员在染色体上的分布

Table 1 Location of maize DCL,AGO and HEN1 gene family members on chromosomes表1 玉米AGO、DCL、HEN1基因在染色体上的位置

2.2 AGO蛋白

miRNA 通过与AGO 蛋白结合形成RNA 诱导沉默复合体，在转录后水平发挥基因沉默功能。AGO 蛋白通常包含一个可变的N 端序列和保守的PAZ 结构域、MID 结构域和PIWI结构域。不同的结构域负责执行不同的功能，MID 结构域负责与miRNA 的5′端磷酸基团结合，PAZ 结构域则与miRNA 3′端结合，PIWI结构域具有切割与miRNA结合的靶基因mRNA 的作用，并通常具有DDH（天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸）基序［38］。玉米中共存在17 个AGO 基因，负责编码18 个AGO 蛋白，其中ZmAGO18b 和ZmAGO18c 由同一个基因的不同转录本编码产生。这些AGO 蛋白分属于3 个主要进化枝，分别为AGO1/5/10、AGO2/3/7 和AGO4/6/8/9，其中AGO1/5/10分枝包含草种特有的一个亚类AGO18［39-40］。玉米AGO蛋白家族在AGO1/5/10 分支中有12 个成员，在AGO2/3/7 分支中有3 个成员，在AGO4/6/8/9 分支中有3 个成员（图3b）。AGO分布在除3号、4号染色体外的多条染色体上，其中2 号染色体分布最多，包含4 个AGO基因（图2，表1）。AGO蛋白作为RNA诱导沉默复合体的关键组分，在植物的生长发育过程中发挥重要作用。玉米AGO1主要在未成熟雌穗中大量表达，其中表达量最高的是ZmAGO1a，研究表明ZmAGO1a 参与雌穗分生组织的发育过程［39］。玉米ZmAGO18 b 在雄穗的花序分生组织和腋生分生组织中高度表达，通过免疫沉淀结合高通量测序，发现ZmAGO18b 偏好于结合5′端为腺嘌呤的24 nt phasiRNA以及5′端为尿嘧啶的21 nt phasiRNA/miRNA，并表现出对miR166 较强的结合偏好性。抑制ZmAGO18b的表达导致miR166的靶基因HD-ZIP III转录因子大量积累，引起玉米小穗数目增加，表明ZmAGO18b 通过调控miR166-HD-ZIP III途径参与花序和腋生分生组织的发育过程［39，41-43］。AGO5c在玉米花药发育早期大量表达，研究发现水稻中与玉米AGO5c 同源性最高的Argonaute MEL1 可以通过与21 nt phasiRNA 结合，参与调控水稻生殖细胞的减数分裂过程［44］，玉米AGO5c 可能也具有类似的功能，在减数分裂前期通过结合phasiRNA调控玉米花粉的发育［43］。玉米ZmRGD2编码一个AGO7-like蛋白，miR390 能够与其结合来影响tasiR-ARF的产生，进而调控生长素信号通路中靶基因ARF3a转录本的降解，引起rgd2突变体叶片的极性发生改变［45］。玉米中存在的多个AGO 家族成员可能具有不同的分工，通过结合不同的小RNA 发挥特异的调控作用，有关其他AGO家族成员的具体功能仍需进一步探讨。

2.3 HEN1甲基转移酶

与DCL 和AGO 相比，HEN1 在玉米中的功能研究较少。HEN1蛋白最初是作为一个花发育相关的基因被筛选出来，它在拟南芥雄蕊和心皮的发育过程中发挥着重要的功能［46］。随后的研究发现，HEN1 是一类高度保守的甲基转移酶，具有5 个结构域，分别为PLD、dsRBD1、dsRBD2、LCD、La结构域，该酶负责将甲基基团转移到位于miRNA和siRNA 3′端核苷酸的2′-OH 位点［47-48］。晶体结构分析表明，HEN1 以单体的形式与底物小RNA 发生特异性结合［49］。甲基化可以增强小RNA的稳定性，hen1突变体中miRNA 3′端的尿苷化修饰程度增加从而促进miRNA 进一步发生降解［47-48］。水稻WAVY LEAF1（WAF1）是拟南芥HEN1的同源基因，WAF1 参与miRNA 和ta-siRNA 的3′端甲基化过程，waf1突变体中miRNA 与ta-siRNA 的表达量下降，突变体呈现出叶片卷曲、植株矮小等表型［50］。与拟南芥hen1突变体相比，幼苗致死与根系发育异常的表型是水稻waf1突变体所特有的。玉米中仅存在一个HEN1基因，位于7 号染色体上（图2，表1）。与拟南芥和水稻类似，HEN1的缺失也导致玉米体内miRNA 的尿苷化程度增加进而发生降解，突变体植株呈现严重的发育缺陷，不能形成正常的顶端分生组织，表明HEN1具有功能保守性，在植物的生长发育中发挥重要作用［51］。

Fig.3 Phylogenetic analyses of DCL and AGO family members图3 DCL、AGO家族成员的系统进化分析

综上所述，玉米中miRNA 生物发生途径的核心组分DCL 核酸内切酶、AGO 蛋白和HEN1 甲基转移酶的突变均导致玉米体内miRNA 不能正常合成或发挥功能，从而使得植株发生严重的表型缺陷，表明miRNA 作为关键的调控因子广泛参与玉米生长发育的多个重要生物学过程。

3 miRNA在玉米生长发育中的功能

miRNA 处于植物基因表达调控网络的上游核心位置，通过对靶基因的表达调控，在植物生长发育的多个方面起到重要的调控作用，如调节细胞分化、极性建成、时相转换等［52］。在模式植物拟南芥和水稻中，已有大量关于miRNA 参与生长发育调控的相关报道［53-54］。然而目前玉米中miRNA 的功能研究仍然相对较少，亟待进一步深入探讨。在已发现参与调控玉米生长发育的miRNA 中，其中一部分具有高度保守性，在不同的植物物种间具有类似的表达模式和功能，同时还存在一些玉米特异的miRNA 在生长发育中也发挥着重要的作用。对于这些miRNA 及其下游靶基因调控网络和分子作用机制的认识将有助于加深对玉米生长发育调控过程的理解。

3.1 调控玉米根部发育的miRNA

植物侧根具有吸收及运输水分、养分以及稳固植物的功能，侧根形态发育对于植物适应环境变化很关键［55］。研究发现，miR164 通过调控靶基因ZmNAC1影响玉米的侧根发育［56］。NAC 是一类植物特异的转录因子，玉米中ZmNAC1的累积促进侧根的生长。玉米和拟南芥的NAC1基因都能够被miR164靶向，表明miR164调控侧根发育的功能在物种间具有一定的保守性［56-57］。

拟南芥中，miR165/166-HD-ZIP III模块负责调控根的生长［58］，该调控模块同样保守存在于玉米中。玉米miR165/166 靶向HD-ZIP III家族成员ROLLED（RLD）。RLD1的功能获得性突变体Rld1-O中由于miR165/166识别位点的突变，使RLD1不能被miR165/166 识别和切割，进而表达水平升高，导致突变体的根部发生多方面的形态变化，包括主根变短、根部直径减小、次生木质部和外皮层细胞数目减少等，表明玉米中miR165/166-RLD1通路在调控根生长中的重要性［59］。

3.2 调控玉米叶片发育的miRNA

miRNA在玉米叶片中的分布具有空间特异性，miR160、miR166、miR168等主要在叶片的分生区表达，miR167、miR396 等在成熟区表达，而miR156、miR399等在伸长区表达量较高［60］，表明叶片的生长发育过程涉及多种miRNA 的参与，这些miRNA 和靶基因构成复杂的调控网络，共同参与叶片形成的过程。

玉米miR166与miR390共同参与调控叶片的极性建成。miR390 能够靶向TAS3基因从而产生tasiR-ARF，这一通路在植物中是高度保守的［61］。tasiR-ARF主要调控植物顶端分生组织的发育过程，miR390 通过调控ta-siRNA 的生成影响叶片发育，在玉米中miR166的表达受到tasiR-ARF的调控，在叶片中呈梯度分布，从而维持叶片极性［45］，利用串联短片段靶标模拟（short tandem target mimic，STTM）技术降低玉米miR166 的表达会导致植株叶片发生卷曲［62］。miR166在玉米叶片背腹面的浓度梯度限定了其靶基因RLD1的空间分布，功能获得性突变体Rld1-O不仅表现出根部发育的缺陷，同时叶片极性也发生改变［14］。rgd2（ago7）和lbl（sgs3）为玉米叶片横向扩展出现问题的突变体，这两个突变体中miR166 的分布都发生了改变，表明miR166 不仅调控玉米叶片的背腹极性，同时还参与调控叶片由中心向两侧的极性建成［45］。

miR156和miR172参与调控玉米幼叶向成熟叶的转变。玉米Corngrass1（Cg1）显性突变体中miR156过量表达，植株叶片表现出细胞层数变少、细胞变小、叶片变窄、同时叶片数量增多的表型［63］。miR172 也是物种间保守的miRNA，利用STTM 技术降低玉米miR172 的表达使叶片幼年期向成年期的转变时期延长［62］。miR172的靶基因为保守的AP2类转录因子。glossy15（gl15）是一个玉米AP2类基因，提高gl15的表达水平可以显著增加玉米幼叶的数目，miR172 通过下调gl15的表达促进幼叶向成熟叶的过渡［15］。miR156 可以抑制miR172 的表达，在Cg1突变体中，miR156 的过量表达导致miR172 的丰度下降低，进而引起gl15表达水平的升高，说明调控玉米幼叶向成熟叶的转变过程受到miR156和miR172的精确调控［63］。

3.3 调控玉米生殖发育的miRNA

玉米具有两种不同的花序：雄性花序和雌性花序。花序大小和分枝数对产量高低具有决定作用，雄穗的分枝数控制花粉的量和授粉时长，而雌穗行数直接影响籽粒的产量，因此均为重要的农艺性状。玉米的雄性花序和雌性花序几乎同时从顶端分生组织产生，末梢的分生组织发育成雄穗，叶腋的一个或多个分生组织发育成雌穗［64］。已报道多个miRNA 参与玉米花序形成和发育的过程［43，63，65］。fuzz tasssel（fzt）是玉米dcl1突变体，DCL1表达量的下降导致miRNA 合成受到抑制，表现出绒毡层退化、花药壁发育缺陷、花粉发育异常等表型，进一步表明miRNA 对玉米花序发育调控的关键作用［37］。

由于miRNA 可以同时靶向多个基因，同一miRNA 可能具有多种生物学功能。Cg1突变体中miR156 的过量表达不仅影响叶片发育，也同时影响雄穗和雌穗分化，由于顶端分生组织缺陷，雄穗成簇出现，不能形成正常的小穗对，雌穗变小且籽粒排列不整齐，同时雄穗和雌穗外围产生大片苞叶［63］。玉米中miR156 的靶基因之一是Teosinte Glume Architecture1（TGA1），Cg1突变体中TGA1表达水平显著降低，TGA1是大刍草向栽培玉米进化的主效QTL，对大刍草和玉米颖片的形态差异有主要贡献［63］。除TGA1外，miR156 还通过靶向TASSELSHEATH4（TSH4）调节穗分枝［66］。tsh4突变体雄穗分枝显著减少，雌穗种子排列混乱［66］。miR156 的另外两个靶基因SBP-box 转录因子UNBRANCHED2（UB2）和UB3也参与调控雌穗和雄穗的发育，ub2 ub3双突变体的雄穗分枝减少而雌穗行数增多。tsh4突变体中，ub2和ub3的表达水平上调。tsh4 ub2 ub3三重突变体的表型类似于miR156过表达的Cg1突变体，表明miR156通过调节这些下游靶基因在调控穗分枝方面发挥重要作用［67］。

miR172 不仅参与调控玉米幼叶向成熟叶的转变，同时也在玉米的性别决定中发挥作用。tasselseed4（ts4）是玉米miR172e的突变体，ts4的突变导致花序远端发生过度分枝，同时雄穗发生雌性化，由于雌蕊不能正常凋亡，使得雄穗部位产生雌性花丝，引起育性显著下降［65］。玉米miR172e的靶基因是indeterminate spikelet1（ids1），该基因编码一个AP2类转录因子，ids1基因在miR172e切割位点发生的点突变导致植株产生类似于ts4突变体的表型，该突变体中由于ids1转录本不能被miR172e靶向剪切从而表达水平升高，进一步证明miR172e通过对ids1进行转录后调控影响玉米的雌雄穗分化［65］。

phasiRNA 是一类内源性的、起调控作用的非编码小RNA，根据长度主要分为两个类群，分别为21 nt 和24 nt 的phasiRNA。21 nt phasiRNA 主要由miR2118 通过触发PHAS前体切割产生，24 nt phasiRNA 由miR2275 触发相应的PHAS前体切割形成［68-69］。在玉米花粉细胞中发现大量21 nt 和 24 nt phasiRNA的存在，它们的表达具有时空特异性，对雄性育性起到重要的调控作用。21 nt phasiRNA 主要在处于减数分裂前的细胞增殖分化期大量产生并迅速消失，而24 nt phasiRNA在减数分裂期大量富集并持续表达至花粉成熟；miR2118特异表达于表皮层细胞，但其诱导产生的21 nt phasiRNA 在花粉细胞中均匀分布，而miR2275 及其所诱导产生的24 nt phasiRNA特异存在于花药绒毡层和减数分裂的细胞［43］。玉米ocl4（outer cell layer 4）、mac1（multiple archesporial cells 1）、ms23（male sterile 23）和msca1（male sterile converted anther 1）等多个雄性不育突变体中均发现21 nt 或24 nt phasiRNA 的缺失，进一步表明phasiRNA对于雄性生殖发育的重要性［43，70］。然而phasiRNA 在玉米花粉细胞中的具体分子调控机制目前还不清楚，仍然需要进一步深入探讨。

3.4 调控玉米籽粒发育的miRNA

玉米籽粒的发育和养分积累大约需要35 d，授粉后10～15 d是玉米种子发育的关键过渡阶段。授粉15 d之前，胚的发育主要集中在组织和器官的形成，而授粉10 d之后，籽粒才开始营养的累积［71］。miRNA 在玉米籽粒的不同发育阶段具有时空表达特异性，通过对玉米处于不同发育时期的籽粒进行小RNA 测序及降解组分析，目前已鉴定获得一系列可能参与调控籽粒发育的miRNA 及其潜在的靶基因［21，71-75］。其中已经有功能研究支持的包括miR164 和miR166［76-77］。在玉米籽粒发育过程中，miR164 随着籽粒的成熟呈现下调的趋势，miR164过量表达植株的籽粒长度与宽度显著降低，同时胚乳体积减小，miR164 主要通过靶向转录因子NAC32和NAC40影响膨胀素基因EXPB14和EXPB15的表达，从而调控细胞壁的延展性影响籽粒发育［76］。利用STTM技术抑制miR166的表达使得玉米籽粒变小、百粒重降低，但miR166 下调同时引起玉米发生多方面表型变化，籽粒性状的改变可能是由于miR166 下降引起植株发育时相转换延缓产生的次级影响［77］。

4 miRNA在玉米非生物胁迫响应中的功能

植物在自然条件下生长的过程中，不可避免的会受到逆境胁迫的影响，包括盐胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、营养胁迫等。miRNA 不仅参与调控植物的生长发育，在植物抵抗逆境胁迫的过程中也发挥着重要的功能。目前通过高通量测序的方法，在玉米中已鉴定到大量参与多种非生物胁迫响应的miRNA，其中对于部分miRNA 也通过功能研究进一步证实了它们在非生物胁迫耐受中发挥的作用。

4.1 盐胁迫响应相关miRNA

盐胁迫是限制植物生长和发育最广泛和严重的非生物胁迫之一，对植物产量和品质具有显著的负面影响［78］。盐胁迫下，植物根系最先感受胁迫信号，继而影响地上部分生长和产生响应。miR169及其靶基因核因子Y的A亚基（NUCLEAR FACTOR-Y subunit A，NF-YA）能够响应盐胁迫而发生表达水平的改变，在玉米的盐胁迫适应过程中发挥调控作用［79-80］。研究发现，过量表达miR169 引起转基因植株耐盐性下降，而抑制miR169 的表达量则使植株的耐盐性增强［80］。盐胁迫条件下，miR169表达水平下降，造成靶基因核因子Y 的A8 亚基（NUCLEAR FACTOR-Y subunit A8，NF-YA8）表达上升，从而使得下游抗氧化酶Peroxidase 1 发生累积，这有利于玉米在盐胁迫环境下对产生的活性氧物质进行清除［80］。此外，Fu等［24］通过对盐胁迫处理下玉米根部和叶片的小RNA 文库和降解组文库分别进行深度测序，鉴定出1 040 个已知的miRNA、37 个新的miRNA 以及其相应的靶基因，其中314 个miRNA 是叶片特异的，278 个miRNA是根系特异的，这些miRNA 可能通过调控靶基因在盐胁迫响应过程中发挥功能。利用盐敏感（Huangzao4）和耐盐玉米自交系（NC28c），也发现一系列差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA 可能在介导玉米不同自交系的盐胁迫适应过程中发挥关键作用［81］。深入分析这些盐胁迫下发生差异表达的miRNA 的功能将有助于理解玉米应对盐胁迫的分子调控机制。

4.2 干旱胁迫响应相关miRNA

干旱已成为影响全球作物生产最严重的非生物胁迫之一，miRNA 作为转录后调控的重要调控因子，在植物的干旱胁迫适应中起着至关重要的作用。Seeve等［82］通过对玉米进行不同程度的缺水胁迫处理，以根系为材料建立小RNA 和降解组文库，利用高通量测序鉴定获得在干旱胁迫下发生差异表达的79 个miRNA 及其所调控的靶基因转录本。此外，利用天然存在的玉米耐旱自交系和干旱敏感自交系，进一步揭示出一系列在玉米不同组织中差异表达的miRNA，这些miRNA对于玉米自交系中不同耐旱性的形成可能具有重要作用［22-23］。目前，已经得到功能研究的包括miR166 和miR169。利用STTM 技术抑制miR166 的表达使得玉米的非生物胁迫抗性提高，其中耐旱性的提高尤为显著，这可能是由于miR166 的降低导致植株中脱落酸（abscisic acid，ABA）的水平上调引起的，ABA是非生物应激反应重要的调节因子，ABA 含量的增加有助于提高玉米的抗旱性［77］。玉米miR169在短期干旱处理后表达明显下调，而其靶基因NF-YA表达上升，从而促进根系的生长以获得更多水分［79］。番茄miR169 过表达会引起气孔开放程度变小，从而增加植物的抗旱能力，但玉米miR169 是否通过类似的机制起到抗旱作用还需要进一步的研究［83］。

4.3 温度胁迫响应相关miRNA

利用小RNA 测序结合转录组分析，目前已鉴定获得大量参与温度胁迫响应过程的miRNA 及其调控的下游靶基因［25-26，84］。温度胁迫主要包括高温胁迫和低温胁迫两个方面。高温胁迫对玉米营养生长期光合作用的进行和生殖生长期雌雄穗的发育具有显著影响。研究发现，在玉米不同发育时期的多个组织中，高温胁迫下大量miRNA 的表达发生了变化，其中在营养生长时期的组织中变化尤为明显，同时长期高温胁迫处理比短期高温胁迫处理对miRNA 表达的影响更大，说明高温胁迫下玉米中miRNA的响应呈高度复杂性和动态性［25］。低温胁迫处理玉米叶片发现，位于叶片分生区、伸长区和成熟区不同miRNA 分别发生了不同程度的表达变化，体现出miRNA 在参与调控叶片低温胁迫适应中具有不同分工［26］。值得注意的是，miR396在高温和低温胁迫下均发生表达量的变化，高温胁迫下miR396 在茎和根中表达量下降，低温冷胁迫下miR396 在叶片分生区下降而在伸长区、成熟区表达上升，暗示miR396 在玉米温度胁迫响应中的重要性［25-26，84］。

4.4 营养胁迫响应相关miRNA

营养胁迫会造成植物的生长受到抑制，甚至导致植物死亡。玉米营养胁迫的相关研究主要集中在低磷胁迫与低氮胁迫两个方面。低磷供应是许多地区玉米产量的限制因素。通过构建玉米叶与根的小RNA 文库结合高通量测序，对磷缺乏条件下差异表达的 miRNA 进行鉴定，发现大量参与低磷胁迫响应的miRNA［27，85］。低磷胁迫下玉米叶与根中miRNA 的表达存在差异，具有组织特异性［27，85］。另外，低磷胁迫响应的早期miRNA 反应迅速，但通常对磷缺乏没有特异性；而响应晚期的miRNA在长期缺乏磷时参与改变植物的形态、生理或代谢［85］。miR399 是一类与低磷胁迫有关的miRNA，拟南芥miR399通过负调控其靶标E2泛素结合基因PHO2参与低磷胁迫响应过程［86］。玉米中miR399-PHO2通路在低磷胁迫适应中也具有保守功能，miR399 主要在玉米的维管系统中表达，在低磷胁迫处理下被诱导，过量表达miR399 使得靶基因PHO2表达下降，从而导致植株中磷的积累显著上升产生磷中毒症状，说明miR399-PHO2模块在维持玉米磷稳态平衡中的重要性［87］。

低氮胁迫严重影响玉米幼苗的生长，导致玉米品质和产量显著下降。通过使用基因芯片技术，在玉米的叶片和根部分别鉴定出9个响应低氮胁迫的miRNA家族［88］。随后，通过小RNA和降解组文库深度测序，在玉米的地上部分与根中进一步鉴定出大量参与低氮胁迫的miRNA 及其调控的下游靶基因［89-90］。值得注意的是，除了miRNA，还发现多个miRNA的随从链miRNA*在低氮胁迫下也发生了明显的表达变化，通常认为miRNA*是miRNA加工过程的副产物，不具有生物学功能，但近期多项研究揭示一部分miRNA*也具有靶基因，在植物的多个生理活动中发挥重要的功能［91］，这些miRNA*的鉴定丰富了低氮胁迫差异表达基因的资源［89］。miR528是单子叶植物特有的miRNA，研究发现氮过量情况下miR528 水平上升，而氮缺乏条件下miR528 水平下降［92］。miR528 主要在玉米的维管束系统表达，miR528 的过量表达引起靶基因漆酶LACCASE3（LAC3）和LACCASE5（LAC5）表达降低，从而影响木质素的积累，导致植株在氮过量条件下容易发生倒伏。缺氮环境下玉米miR528 表达下降，使得LAC3、LAC5表达上升，有助于木质素在玉米茎上累积，从而有助于提高玉米的抗倒伏性［92］。

5 总结与展望

Fig.4 Key miRNAs and their target genes involved in regulating maize development and abiotic stress responses图4 参与调控玉米生长发育和非生物胁迫响应的关键miRNA及其靶基因

Table 2 Key miRNAs regulating maize development and abiotic stress responses表2 调控玉米生长发育和非生物胁迫响应的关键miRNA

miRNA 研究是表观遗传学的热门研究领域之一，大量研究表明miRNA 通过复杂的调控网络参与植物体内多种重要的生理活动。随着遗传筛选、生物信息学分析以及高通量测序技术的运用，在玉米中已鉴定获得大量参与生长发育调控和非生物胁迫响应的miRNA，其中部分miRNA的功能已经得到验证，图4和表2中总结了目前已有功能研究支持的关键miRNA 及其调控的靶基因。然而，整体来说，关于玉米中miRNA 具体功能和作用机制的研究仍然相对有限，需要进一步创制突变体等遗传材料，结合分子生物学、遗传学、基因组学等多种手段开展深入的功能研究。目前，通过过量表达miRNA，利用串联短片段靶标模拟STTM 技术沉默抑制miRNA，或者通过CRISPR/CAS9 基因编辑技术构建miRNA突变体，都可以实现对miRNA表达水平的调节进而研究其对玉米重要农艺性状的影响，进一步确认miRNA 的具体功能。总体来说，与拟南芥、水稻中miRNA 的研究相比，目前玉米中的相关研究仍然非常有限，主要集中在对处于不同生长发育过程和不同非生物胁迫条件下玉米中miRNA 的鉴定，仍然缺乏深入和系统的功能机制解析，同时对于miRNA 如何相互协调作用、如何参与由多个调控通路组成的复杂调控网络也知之甚少，因此进一步探讨玉米miRNA 的生物学功能及其参与的复杂调控网络将是今后的工作重点。尤其值得关注的是，玉米中存在大量单子叶植物特有miRNA，这在双子叶模式植物拟南芥中是无法进行研究的，发现这些新的miRNA 并对其进行功能解析对于理解单子叶植物生长发育调控和非生物胁迫适应的过程具有重要意义。