基于网络药理学和分子对接探讨智脑胶囊改善阿尔茨海默病的作用机制

余郭芳，田丽伟，赵晨玲，吴梦婷，杨文明，董婷*

(1.安徽中医药大学 第一临床医学院，安徽 合肥 230038;2.安徽中医药大学 第一附属医院，安徽合肥230031)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一类以记忆功能下降和认知受损为主要临床特征的神经系统变性病，多发病于老年人[1]。有调查报道AD在60岁以上人群中发病率高达为2.22%[2]，已严重威胁老年人的生活质量。但时至今日，AD的发病机制尚未明确，化学药物抗AD的效果仍不显著，且不良反应多，因此研发安全有效的药物刻不容缓。

安徽中医药大学第一附属医院以党参、黄精、川芎、石菖蒲为主要药材，研发了智脑胶囊[3]。君药为党参，起养血生津、荣养脑窍之效，臣药为石菖蒲和黄精，行益精填髓、益智化痰之功，佐用川芎活血行气，共凑补肾益髓、益智化瘀、健脾豁痰之效[4]。此复方抗AD作用在临床及动物实验中均已证实[5-6]。但智脑胶囊治疗AD的作用机制在分子层面上缺乏系统的生物学分析，故本研究运用网络药理学进一步分析药物与疾病的相互关系，对智脑胶囊治疗AD的可能机理进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 筛选智脑胶囊有效成分和AD靶点

在TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库中，以智脑胶囊中各单味中药的名称(党参、川芎、黄精、石菖蒲) 为关键词进行检索，确定口服生物利用度( oral bioavailability，OB) ≥30% 和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为设置标准，在Uniprot数据库(https://www.Uniprot.org/)帮助下，将筛选出的每种中药有效成分和相对应的可能靶点进行修正，并转换成标准的基因名，设置限定物种为人类，由此获得了智脑胶囊活性成分靶点。

在TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)中检索“Alzheimer′s disease”，在获得AD相关靶点数据后,再对每个靶位进行合并去重。

1.2 构建智脑胶囊与AD相关靶标的交集

为了深入研究智脑胶囊与AD之间的关系，本文采用Venny 2.1在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获取AD和智脑胶囊活性成分的交互靶标，最后运用软件Cytoscape3.7.1制作中药-活性成分-靶点网络模型。

1.3 构架蛋白质-蛋白质相互作用网络

导入AD的潜在作用靶点至STRING (https://string-db. org/)数据库，定义物种为人类，获取蛋白与蛋白之间的交互信息，接着把获得的数据导入软件 Cytoscape3.7.1，绘制蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络图。最后通过CytoNCA 插件分析度数中心性(degree centrality，DC)、间隔中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)等内容，根据多次中位数筛选获得核心基因。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

运用 Metascape数据库(https://metascape.org)对交集基因实施 GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes )富集分析。基因功能分别从细胞组成(cell composition，CC)，生物过程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)等多个层面进行注释。过滤条件为P<0.05，输出分析结果。然后借用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)将结果可视化处理，并绘制相应的条形图与气泡图。

1.5 分子对接

为检验上述分析结果的准确性，利用分子对接计算出1.2节得到的智脑胶囊关键活性成分与AD认知障碍的核心靶点之间的结合能，评价其结合活性。首先选取度值前3的核心靶点，找到其对应的关键成分，再在TCMSP数据库中下载关键成分的小分子配体文件，使用AutoDockTools 1.5.6加氢处理后输出为pdbqt格式。大分子受体文件首先在Uniprot数据库中搜寻核心靶点，经已验证及人类物种筛选后，复制核心靶点的基因ID，利用基因ID在PDB数据库中下载对应的大分子，输出为pdb格式，同样使用软件AutoDockTools 1.5.6进行脱水加氢处理，以pdbqt格式输出。将配体受体文件经利用 Autodock Vina进行对接，计算各靶点之间的结合能，最后利用Pymol 2.4.2软件将结果可视化分析。

2 结果与分析

2.1 收集智脑胶囊有效成分及靶点

通过TCMSP数据库的收集筛选并结合文献数据，去重整理后共得到智脑胶囊活性成分24个，主要活性成分见表1，全表见OSID科学数据与内容附表1。其中党参10个，黄精6个，石菖蒲4个，川芎3个，川芎与石菖蒲共同成分1个。

表1 智脑胶囊主要活性成分信息Table 1 Information on the active ingredients of Zhinao Capsules

2.2 中药-活性成分-靶点网络图

将智脑胶囊的有效成分和药物基因靶点导入Cytoscape3.7.1软件中绘制中药-有效成分-靶点网络结构图，见OSID科学数据与内容附图1。

该图由198个节点、315个边组成，其中包括有效成分24个，靶点170个。平均单个节点作用1.5个靶点，单个有效成分对应7个靶点。这也揭示了智脑胶囊治疗的AD是采用多成分、多靶点、多路径方法来发挥作用的。用CytoNCA 插件对该网络图进行拓扑分析后，选取DC值最高的的木犀草素、山奈酚、黄芩苷，表明这些有效活性成分可能为智脑胶囊关键成分。

2.3 预测智脑胶囊治疗AD的靶点

以“Alzheimer’s disease”为关键词在OMIM、GeneCards 、TTD等数据库中分别检索到相关靶点1 329个、 1 735个、1 844个，去重后取其交集基因，得到

疾病基因靶点共645个，最后利用维恩图，如图1所示，将上述疾病基因靶点与药物靶点进行匹配，最终获得交集靶点58个。

图1 疾病与药物交集靶点图Fig.1 Matching target between disease and drug

2.4 PPI网络图的构建

将筛选出的58个AD基因靶点和智脑胶囊药物靶点导入STRING数据库进行PPI分析，选择人类为研究物种，设置最低置信区间<0.9，并把无关联的游离点隐藏起来，绘制出靶蛋白的PPI网络图，最后导入Cytoscape3.7.1可视化处理，见OSID科学数据与内容附图2，节点越大，颜色越深，代表其相关度越高，根据度值选取排名前3的靶点，分别为AKT1(degree=49)、IL-6(degree=47)、TNF(degree=46)。

2.5 智脑胶囊治疗AD靶点的GO、KEGG富集分析

借助Metaspace数据库，将共同靶点导入后进行生物通路过程分析，得到1 225条BP、65条CC、99条MF，KEGG富集分析得到174条目录。以P值为筛选条件选取GO功能BP、CC、MF各前10条目录。如OSID科学数据与内容附图3所示，得出智脑胶囊生物功能主要涉及激素反应、氮化合物、磷酸化正调控、活性氧反应等，细胞组分以膜筏、膜小凹、突触后膜、树突等为主，分子功能涉及泛素样蛋白连接酶结合和磷酸酶结合等。前20条的KEGG信号通路主要包含脂质与动脉硬化、TNF信号通路，见OSID科学数据与内容附图4。

2.6 分子对接验证

依据2.2和2.4结果，选择度值前三的智脑胶囊关键有效成分木犀草素、山奈酚、黄芩苷以及靶点AKT1、IL-6、TNF，运用Autodock Vina软件将其分别进行对接，计算结合能，得到TNF与山奈酚、黄芩苷、木犀草素分别为-8.0、-7.3、-7.1 kcal/mol(1 cal=4.186 J)，AKT1与山奈酚、黄芩苷、木犀草素分别为-5.5、-6.7、-6.0 kcal/mol，IL-6与山奈酚、黄芩苷、木犀草素分别为-6.1、-6.2、-6.3 kcal/mol,见表2。选取结合能前三的山奈酚与TNF、黄芩苷与TNF、木犀草素与TNF利用Pymol软件将其结合位点进一步可视化分析，结果见图2。

表2 关键活性成分与核心靶点的结合能Table 2 Binding energy of key active ingredients to core targets

图2 关键成分与核心靶点分子对接图Fig.6 Docking diagram of key ingredients and core target molecules

3 讨论

AD被认为属于中医 “呆病”“健忘”等疾病范畴。《素问》云“肾封藏之本，精之处也”。《伤寒论》记载“……本有久瘀血，故令善忘”。朱丹溪提出“健忘……多亦有痰”。故中医以为“肾精亏虚，髓减脑消”是该病病机基础，“痰瘀互结”是病机关键。智脑胶囊作为本院内制剂，善于填精益髓的同时兼备豁痰化瘀。临床用于改善患者记忆功能[7]，动物实验亦证明智脑胶囊通过调控胆碱能通路[8]、下调淀粉APP mRNA的表达来改善小鼠记忆功能[9]。

淀粉样蛋白(Amyloid-β , Aβ)可以激活神经胶质细胞释放大量炎性细胞因子和毒性介质形成神经炎症，引起神经细胞死亡，这会进一步刺激加重AD患者脑内的炎症反应，致使患者病情进一步加重。且有学者发现AD患者TNF-α和IL-6水平有明显升高的趋势[10]，抗炎也是西药治疗AD的重要手段。因此炎症反应与AD发病机制密切相关。

(1)山奈酚、黄芩苷、木犀草素是智脑胶囊治疗AD的关键有效成分

本研究发现山奈酚、黄芩苷、木犀草素与AD相关靶点作用最为密切，相关文献证实其可以通过抗炎抗氧化等途径来改善记忆功能[11-14]。黄芩苷通过促进Beclin1和微管结合蛋白1轻链3分子(LC3)的生成并减少淀粉肽的生成来发挥保护神经细胞的作用[11-13]。山奈酚可以增强NF-κB、磷酸化 p38 丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)等信号通路的表达，来实现抗炎抗氧化作用[15-17]。作为山奈酚同分异构体的木犀草素，同样具备抗炎抗氧化作用，通过激活Akt信号表达，降低氧化应激水平，达到抗氧化作用[18-20]。因此，可以推测它们是智脑胶囊治疗AD的关键有效成分。

(2)AKT1、IL-6、TNF为智脑胶囊治疗AD的核心靶点

依据PPI网络分析的结果， AKT1、IL-6、TNF可能是智脑胶囊治疗AD的核心靶点。AKT作为蛋白激酶，AKT1是其中一种亚型，位于PI3k蛋白下游，具有调节细胞功能，抑制细胞凋亡等作用[21]。例如当AKT蛋白被激活时，促进下游NF-κB在细胞质中的表达，增强细胞存活[22]；还可以上调mTOR的表达来减少Aβ40的生成[23]；此外AKT还可以抑制GSK-3β的表达，继而抑制Tau蛋白磷酸化，改善小鼠的记忆能力[24]。TNF分为TNF-α和TNF-β，和IL-6相似，同为促炎症因子，可以诱导神经元的凋亡，上调淀粉样前体蛋白( amy-loid protein precursor，APP)的表达[25]。因此抑制炎症通路的表达可以提升一定的学习记忆能力，改善AD症状[26]。

(3)智脑胶囊治疗AD的可能机制

GO功能富集分析，结果表明智脑胶囊通过激素反应、磷酸化调控和氧化应激等BP，泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合、磷酸酶结合等MF，神经细胞的膜筏、膜小凹、突触后膜、树突等CC治疗AD。KEGG结果显示智脑胶囊治疗AD的核心通路涉及脂质与动脉硬化、TNF信号通路。APP通过α 分泌酶和β 分泌酶切割后形成Aβ淀粉样蛋白，动物实验证实脂质的降低可以上调分泌酶的表达，促进 Aβ的生成。动脉粥样硬化则可引起脑部缺血，增加脑部淀粉样蛋白的沉积以及神经炎症因子的释放。因此抑制脂质与动脉硬化通路的表达，可以减少Aβ的沉积、减轻神经炎症，缓解认知障碍[27]。TNF信号通路诱导细胞凋亡并促进炎症因子产生。智脑胶囊的关键成分山奈酚、木犀草素和黄芩苷均具有抗炎能力，由此推测智脑胶囊主要是通过调控TNF信号发挥抗炎作用，减轻神经炎症反应，达到治疗AD的效果。分子对接结果表明，TNF靶点对山奈酚、木犀草素和黄芩苷显示出良好的结合能力。其中山奈酚结合能力更佳，结合能-8.0 kcal/mol。这恰好符合网络药理学的分析结果。

4 结语

本研究利用网络药理学方法和分子对接技术，对智脑胶囊治疗AD的作用机理开展了初步探讨。结果显示，山奈酚、黄芩苷、木犀草素是智脑胶囊的关键有效成分，并作用核心靶点TNF，并通过脂质与动脉硬化和TNF信号通路抑制Aβ生成，减轻炎症反应。这奠定了大智脑胶囊在临床使用的理论依据,同时也为今后更进一步的实验研究打下了基础。