非洲猪瘟病原学特征及其疫苗的研究进展

2023-02-24 15:39刘小琬岳双明周远成
四川畜牧兽医 2023年11期
关键词:活疫苗毒株猪只

刘小琬,许 辉,王 寒,岳双明,周远成

(1.四川水利职业技术学院,四川 成都 611200;2.四川省畜牧科学研究院畜禽生物制品四川省重点实验室,四川 成都610066,3.畜科生物工程有限公司四川省动物生物制品工程技术研究中心,四川 成都 610200)

ASFV 感染以肺水肿、发烧、皮肤发绀、网状内皮系统出血为主要特征,死亡率高达100%,严重危害养猪业,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定上报动物疫病之一,是我国一类动物疫病[1]。非洲猪瘟的传播史已逾一个世纪,1921年非洲东部肯尼亚最早报道ASF,20世纪50年代传入欧洲、葡萄牙、西班牙等国,开始了在西欧的流行[2]。20世纪70年代传入巴西等欧美地区,2007年ASFV叩响了亚洲的大门,俄罗斯、格鲁吉亚相继暴发疫情。我国于2018 年8 月在沈阳首次报道ASFV,截至2022 年7 月,我国已累计报道192起,扑杀生猪共计120多万头,目前没有再出现区域性暴发流行。疫情暴发初期,我国生猪养殖存栏量急剧下降,猪肉曾一度供不应求,从而导致生猪和猪肉产品价格上涨幅度过大[4]。尽管全世界对ASFV 疫苗研究已有几十年,但还没有一个疫苗批准上市,因此,了解ASFV主要保护性抗原结构及其疫苗的研究进展,对于防控ASF疫情具有十分重要的意义。

1 非洲猪瘟病毒的病原学特征

1.1 结构特点 ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,也是目前已知的唯一虫媒大型DNA 囊膜病毒。病毒粒子呈正二十面体对称结构,直径约200 nm,长度为170~190 kb,有160~175个开放阅读框(ORFs),可编码150~200 种蛋白质,包括多种结构蛋白及参与DNA复制、修复、转录的酶和因子等,其表达受时间调控。

1.2 ASFV 的病毒蛋白 ASFV 的开放阅读框可编码病毒不同抗原表位,其中结构蛋白有pp220、p30、p54、p72、A104R 和CD2v 等,非结构蛋白有F334L、K196R 和NP419L,未知功能蛋白有B602L、C44L、Cp312R和K205R。其中p54、K205R、A104R 和B602L 这4 种蛋白产生的抗体具有更强、更持久的抗体滴度。ASFV 可在主动脉内皮细胞及巨噬细胞中复制,通过胞吞作用进入细胞,前期有试验研究表明,p30、p54、pp62、p72 及CD2v蛋白有助于病毒的快速吸附和入侵。

p30 蛋白是ASFV 重要的结构蛋白,由CP204L 基因所编码,相对分子量为30 ku,是ASFV 早期表达的内膜蛋白,在感染早期可检测到表达,并持续存在于整个感染周期。因其有较强的抗原性和免疫原性,可刺激机体产生特异性抗体,常用于血清学诊断。周改静等[4]利用原核表达p30蛋白建立了阻断ELISA检测方法,对208份血清样品进行检测,结果与Ingenasa 公司试剂盒检测的结果一致。

p54 蛋白是由E183L 编码的ASFV 的另一个结构蛋白,分子量约为25 ku,在其N 端附近有一个潜在的跨膜区域和Gly-Gly-X 氨基酸序列,对病毒形态的形成非常重要,对包膜前体聚集及病毒粒子组装转运有很重要的作用。p54蛋白诱导产生的抗体能够抑制ASFV 附着到易感细胞中,感染后最早一个星期就能检测,并能在血液中持续数周,也常被应用于ASFV的血清学诊断中。

p72 蛋白是病毒二十面体衣壳的主要成分,由B646L基因编码,分子量大小约为73.2 kDa,抗原性及免疫原性强而稳定,产生的抗体可阻断ASFV与巨噬细胞的结合。在病毒感染末期能检测到p72 蛋白表达,它与病毒的吸附、入侵有关,p72 的表达是病毒复制的标志,广泛应用于病毒检测方法的建立。周远成等[5]利用真核表达载体及辅助蛋白B602L 基因协同表达p72 蛋白,重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p72、B602L蛋白,将该重组腺病毒接种实验动物,可刺激实验动物产生特异性抗体,为今后建立特异性强、稳定性好和结合能力高的ASFV 血清学诊断方法奠定了良好的基础。

CD2v 蛋白是由EP402R 基因编码,具有跨膜结构的糖蛋白,类似于T 淋巴细胞表面的黏附受体CD2,是唯一已知的细胞CD2 的同源物,主要参与细胞间的黏附、毒性增强以及免疫应答调节过程,与ASFV的组织趋向性、免疫逃避机制等密切相关,在ASFV 感染的发病机制中可能有一定的作用,属于晚期表达蛋白。CD2v蛋白可破坏淋巴细胞功能,影响机体对病毒感染后的清除,并阻碍机体产生免疫保护作用。

1.3 传播途径 ASF在一个世纪前就已出现,在全球经济一体化的趋势下,已导致全球60多个国家流行。ASFV 是一类可经虫媒传播的病毒,在软蜱中可存活数月至数年,带毒的软蜱通过叮咬家猪使病毒得以扩散,可感染家猪和野猪。发病动物的分泌物、排泄物、组织及被污染的饲料、饮水、泔水、车辆等也可传播病毒,可经由呼吸道、消化道、肌肉等多种途径感染猪群。我国ASF的暴发,主要是由于生猪调运频繁、散养户过多、基层生物防控意识薄弱及感染猪只副产品的大范围运输导致的。

1.4 临床表现 ASFV感染猪只后会在淋巴结中大量繁殖,扩散后形成病毒血症,并在肺脏、肾脏、肠道等器官中进一步复制,从而引起严重的病理损伤,导致血管通透性增加,引起脏器严重出血。尤其是高毒力株感染后,最急性ASF的症状表现为病猪发热,成堆拥挤在一起,往往无明显症状就突然倒地死亡;急性ASF的临床症状表现为高热稽留,共济失调,四肢发绀,多脏器出血,充血性脾肿大,肺脏水肿,淋巴细胞减少症和血小板减少症等[6]。低毒力株一般病死率低,临床症状不明显,呈持续性感染,表现为妊娠母猪流产,逐渐消瘦、跛行,关节肿大和皮肤溃疡等,并会长期排毒[7]。

1.5 致病机制 ASFV 主要侵袭宿主的单核-巨噬细胞,感染过程非常复杂,影响因素众多,还依赖多个细胞因子[8]。前期研究证实,ASFV进入细胞的内吞途径主要由网格蛋白介导和发动蛋白介导。除此之外,ASFV 也能通过大胞饮的方式进入细胞,这主要是依赖细胞膜局部的不稳定性来实现[9]。ASFV 进入细胞后,ASFV 颗粒从早期的内吞体移动到晚期的内吞体,并依赖内吞体内的酸性环境完成脱壳。ASFV感染会导致细胞内胆固醇向“病毒工厂”富集,这可能对ASFV 的膜融合和病毒复制起到至关重要的作用。ASFV病毒粒子的组装涉及依赖微管的波形蛋白的重排,病毒粒子成熟后,依靠微管蛋白转运到细胞膜,并通过出芽方式从细胞中释放[10]。

2 非洲猪瘟疫苗的研究进展

ASF 流行100 多年,目前还没有一种成熟的疫苗可以防控,因该病毒具有强大而复杂的免疫逃逸机制,主要保护性抗原尚未完全明确,病毒基因型多且易变异,所以关于ASF疫苗使用的争议从未间断,尤其是在疫苗研发评估、临床应用方面需谨慎。即便道路坎坷,学者们仍在为ASFV疫苗的研制不断努力,并取得一定的成效,目前主要研究的是灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗。

2.1 灭活疫苗 灭活疫苗是目前技术已经很成熟的一种传统疫苗研制方法,通过细胞培养出大量的病毒,经过一系列化学或物理方式使病毒丧失致病性,同时保持病毒抗原颗粒的完整性,从而刺激机体产生保护性抗体。关于ASFV灭活疫苗的最新研究是在2014年进行的,用新型现代佐剂对其进行了安全性测试,但是这些方法并没有让接种猪群得到有效保护。Estefania等[11]在低温下用低浓度的二乙烯亚胺(BEI)灭活病毒,联合新的强效佐剂,通过皮内、肌内同时双重接种,4周后用相同剂量和注射方式进行增强免疫,接种6 周后肌肉注射强毒株攻毒,结果所有动物均有ASF的临床症状和病理表现,说明采用灭活疫苗没有对ASFV攻击产生有效保护。ASF灭活疫苗采用了各种新型的保护佐剂,迄今为止研究结果显示ASF灭活疫苗无法提供有效保护,可能是由于病毒表面蛋白差异性很大,不是所有的抗原在失活后还保留完整结构,因此影响了免疫效果,也表明细胞免疫在预防ASFV 中的重要性。而要产生细胞反应,宿主细胞中必然有大量的病毒复制,这为减毒活疫苗的有效性提供了理论基础。

2.2 减毒活疫苗

2.2.1 传统减毒活疫苗 减毒活疫苗毒性明显减少,既保持了原有的抗原性,又诱导体内产生强烈持久的免疫应答,但因其存在毒力返强及病毒变异的问题,极大地限制了该类疫苗的应用。葡萄牙在1962 年启动了非洲猪瘟弱毒疫苗田间试验,结果出现母猪流产、皮肤坏死、关节炎、肺部损伤等慢性感染现象[12-13]。利用从软蜱或者慢性感染猪只体内分离到的天然弱毒株(OURT88/3和NH/P68)而制备的减毒活疫苗(LAV),在接种猪只后可以对同源毒株产生很好的免疫保护,不同的免疫途径、接种剂量、攻毒株会产生不同的保护率[14]。通过非敏感细胞Vero细胞连续传110代致弱的LAV,在免疫猪群后,其体内复制能力降低,毒力逐步丧失,毒力基因的表达能力明显下降,不能抵抗亲本毒株的攻击,也就不能提供有效的保护。

2.2.2 基因工程减毒活疫苗 ASF减毒活疫苗具有毒株特异性,传统天然弱毒及人工培养弱化制备的LAV,其免疫效果差异巨大,包括残余毒力、病毒血症和亚临床症状等,因此越来越多的学者开始研究基因缺失弱毒苗,认为其安全性及可靠性更高。张艳艳等[15]以SY18 为亲本株构建了ASFV MGF 和CD2v 基因缺失疫苗候选株,并对其安全性和免疫保护效果进行了特性研究,结果显示,该双基因缺失株能够抵抗亲本强毒株SY18株的攻击。Elisabeth 等[16]用Ba71 ASFV 毒株基因缺失苗(缺失CD2基因)免疫猪只,能激活免疫系统并产生较强的抗体水平,有效抵抗亲本毒株Ba71 和异源E75 毒株(两种基因型Ⅰ株)的致命攻击。这些结果为将来研发ASFV交叉保护疫苗开辟了新途径,表明基于CD2v 的减毒活疫苗具有较大的开发前景,这对于在病毒流行和多种毒株传播地区的ASFV 防控至关重要。目前ASFV重组致弱活疫苗主要集中于敲除TK、9GL、UK、EP402R、NL、MCF 360/55 基因,可以让病毒毒力减弱且兼具较好的免疫原性。备受关注的哈兽研的非洲猪瘟7 基因缺失减毒活疫苗(ASFV-7GD)已开展相关临床试验,若能通过安全性和免疫原性检测,同时找到稳定的生产细胞系,有可能成为首个商品化ASF疫苗。

2.3 亚单位疫苗 传统亚单位疫苗是将可控蛋白质分解或水解后纯化,进而筛选出具有免疫活性的小分子片段制备成疫苗。因没有病毒核酸,克服了传统减毒活疫苗灭活不完全、毒力返强等问题,安全性更好,但保护效力相对较弱。利用杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒作为病毒载体,能刺激细胞免疫,提供更优秀的免疫保护效率,布局该技术路径的包括普莱柯生物股份、中牧股份等企业。ASFV的CD2v 不是强免疫原性抗原,因此需接种较大剂量的蛋白质才能诱导产生较高的抗体水平。用杆状病毒表达的p54/p30 融合蛋白免疫猪群,可以产生一定量的中和抗体,并在攻毒后改善病程,减少病毒血症的发生,同时保护猪只免受E75 的致命攻击。利用杆状病毒来表达的CD2v/p54/p30 蛋白,在免疫猪群后能产生中和抗体抵抗强毒株的攻击,但会出现不同程度的病毒血症。ASFV 基因组结构庞大复杂,编码蛋白多且容易发生变异,是影响疫苗研发和免疫效果的重要因素之一。p72 蛋白在体外单独表达时容易出现错误折叠,用辅助蛋白B602L 共表达时可得到正确折叠构象的p72 蛋白[17]。将表达ASFV B646L、EP153R、EP402R 的抗原重组痘苗病毒免疫猪只后,能够诱导IFN-γ分泌和T淋巴细胞增殖分化,但不能诱导机体体液免疫应答[18]。

3 展望

伴随经济全球化发展,跨地域的人员和贸易流通加快,养殖密度不断提高,养殖模式越来越多样化等,给ASF 的防控带来更加严峻的挑战,而ASF疫苗的研究历来是一个世界性难题,尽管各国科学家们进行了各种不同的尝试,但由于其基因组结构复杂,免疫逃避机制尚未研究透彻,至今仍无商业化的疫苗上市,给世界养猪业带来了严重的损失和威胁。随着生物学技术的不断发展,以及对ASFV发病机制、免疫逃逸机制等的深入研究,相信在不久的将来,安全、可控的ASF疫苗定会成功问世。

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