非洲猪瘟病原学特征及其疫苗的研究进展

刘小琬，许 辉，王 寒，岳双明，周远成

（1.四川水利职业技术学院，四川 成都 611200；2.四川省畜牧科学研究院畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都610066，3.畜科生物工程有限公司四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610200）

ASFV 感染以肺水肿、发烧、皮肤发绀、网状内皮系统出血为主要特征，死亡率高达100%，严重危害养猪业，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定上报动物疫病之一，是我国一类动物疫病［1］。非洲猪瘟的传播史已逾一个世纪，1921年非洲东部肯尼亚最早报道ASF，20世纪50年代传入欧洲、葡萄牙、西班牙等国，开始了在西欧的流行［2］。20世纪70年代传入巴西等欧美地区，2007年ASFV叩响了亚洲的大门，俄罗斯、格鲁吉亚相继暴发疫情。我国于2018 年8 月在沈阳首次报道ASFV，截至2022 年7 月，我国已累计报道192起，扑杀生猪共计120多万头，目前没有再出现区域性暴发流行。疫情暴发初期，我国生猪养殖存栏量急剧下降，猪肉曾一度供不应求，从而导致生猪和猪肉产品价格上涨幅度过大［4］。尽管全世界对ASFV 疫苗研究已有几十年，但还没有一个疫苗批准上市，因此，了解ASFV主要保护性抗原结构及其疫苗的研究进展，对于防控ASF疫情具有十分重要的意义。

1 非洲猪瘟病毒的病原学特征

1.1 结构特点 ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前已知的唯一虫媒大型DNA 囊膜病毒。病毒粒子呈正二十面体对称结构，直径约200 nm，长度为170～190 kb，有160～175个开放阅读框（ORFs），可编码150～200 种蛋白质，包括多种结构蛋白及参与DNA复制、修复、转录的酶和因子等，其表达受时间调控。

1.2 ASFV 的病毒蛋白 ASFV 的开放阅读框可编码病毒不同抗原表位，其中结构蛋白有pp220、p30、p54、p72、A104R 和CD2v 等，非结构蛋白有F334L、K196R 和NP419L，未知功能蛋白有B602L、C44L、Cp312R和K205R。其中p54、K205R、A104R 和B602L 这4 种蛋白产生的抗体具有更强、更持久的抗体滴度。ASFV 可在主动脉内皮细胞及巨噬细胞中复制，通过胞吞作用进入细胞，前期有试验研究表明，p30、p54、pp62、p72 及CD2v蛋白有助于病毒的快速吸附和入侵。

p30 蛋白是ASFV 重要的结构蛋白，由CP204L 基因所编码，相对分子量为30 ku，是ASFV 早期表达的内膜蛋白，在感染早期可检测到表达，并持续存在于整个感染周期。因其有较强的抗原性和免疫原性，可刺激机体产生特异性抗体，常用于血清学诊断。周改静等［4］利用原核表达p30蛋白建立了阻断ELISA检测方法，对208份血清样品进行检测，结果与Ingenasa 公司试剂盒检测的结果一致。

p54 蛋白是由E183L 编码的ASFV 的另一个结构蛋白，分子量约为25 ku，在其N 端附近有一个潜在的跨膜区域和Gly-Gly-X 氨基酸序列，对病毒形态的形成非常重要，对包膜前体聚集及病毒粒子组装转运有很重要的作用。p54蛋白诱导产生的抗体能够抑制ASFV 附着到易感细胞中，感染后最早一个星期就能检测，并能在血液中持续数周，也常被应用于ASFV的血清学诊断中。

p72 蛋白是病毒二十面体衣壳的主要成分，由B646L基因编码，分子量大小约为73.2 kDa，抗原性及免疫原性强而稳定，产生的抗体可阻断ASFV与巨噬细胞的结合。在病毒感染末期能检测到p72 蛋白表达，它与病毒的吸附、入侵有关，p72 的表达是病毒复制的标志，广泛应用于病毒检测方法的建立。周远成等［5］利用真核表达载体及辅助蛋白B602L 基因协同表达p72 蛋白，重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p72、B602L蛋白，将该重组腺病毒接种实验动物，可刺激实验动物产生特异性抗体，为今后建立特异性强、稳定性好和结合能力高的ASFV 血清学诊断方法奠定了良好的基础。

CD2v 蛋白是由EP402R 基因编码，具有跨膜结构的糖蛋白，类似于T 淋巴细胞表面的黏附受体CD2，是唯一已知的细胞CD2 的同源物，主要参与细胞间的黏附、毒性增强以及免疫应答调节过程，与ASFV的组织趋向性、免疫逃避机制等密切相关，在ASFV 感染的发病机制中可能有一定的作用，属于晚期表达蛋白。CD2v蛋白可破坏淋巴细胞功能，影响机体对病毒感染后的清除，并阻碍机体产生免疫保护作用。

1.3 传播途径 ASF在一个世纪前就已出现，在全球经济一体化的趋势下，已导致全球60多个国家流行。ASFV 是一类可经虫媒传播的病毒，在软蜱中可存活数月至数年，带毒的软蜱通过叮咬家猪使病毒得以扩散，可感染家猪和野猪。发病动物的分泌物、排泄物、组织及被污染的饲料、饮水、泔水、车辆等也可传播病毒，可经由呼吸道、消化道、肌肉等多种途径感染猪群。我国ASF的暴发，主要是由于生猪调运频繁、散养户过多、基层生物防控意识薄弱及感染猪只副产品的大范围运输导致的。

1.4 临床表现 ASFV感染猪只后会在淋巴结中大量繁殖，扩散后形成病毒血症，并在肺脏、肾脏、肠道等器官中进一步复制，从而引起严重的病理损伤，导致血管通透性增加，引起脏器严重出血。尤其是高毒力株感染后，最急性ASF的症状表现为病猪发热，成堆拥挤在一起，往往无明显症状就突然倒地死亡；急性ASF的临床症状表现为高热稽留，共济失调，四肢发绀，多脏器出血，充血性脾肿大，肺脏水肿，淋巴细胞减少症和血小板减少症等［6］。低毒力株一般病死率低，临床症状不明显，呈持续性感染，表现为妊娠母猪流产，逐渐消瘦、跛行，关节肿大和皮肤溃疡等，并会长期排毒［7］。

1.5 致病机制 ASFV 主要侵袭宿主的单核-巨噬细胞，感染过程非常复杂，影响因素众多，还依赖多个细胞因子［8］。前期研究证实，ASFV进入细胞的内吞途径主要由网格蛋白介导和发动蛋白介导。除此之外，ASFV 也能通过大胞饮的方式进入细胞，这主要是依赖细胞膜局部的不稳定性来实现［9］。ASFV 进入细胞后，ASFV 颗粒从早期的内吞体移动到晚期的内吞体，并依赖内吞体内的酸性环境完成脱壳。ASFV感染会导致细胞内胆固醇向“病毒工厂”富集，这可能对ASFV 的膜融合和病毒复制起到至关重要的作用。ASFV病毒粒子的组装涉及依赖微管的波形蛋白的重排，病毒粒子成熟后，依靠微管蛋白转运到细胞膜，并通过出芽方式从细胞中释放［10］。

2 非洲猪瘟疫苗的研究进展

ASF 流行100 多年，目前还没有一种成熟的疫苗可以防控，因该病毒具有强大而复杂的免疫逃逸机制，主要保护性抗原尚未完全明确，病毒基因型多且易变异，所以关于ASF疫苗使用的争议从未间断，尤其是在疫苗研发评估、临床应用方面需谨慎。即便道路坎坷，学者们仍在为ASFV疫苗的研制不断努力，并取得一定的成效，目前主要研究的是灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗。

2.1 灭活疫苗 灭活疫苗是目前技术已经很成熟的一种传统疫苗研制方法，通过细胞培养出大量的病毒，经过一系列化学或物理方式使病毒丧失致病性，同时保持病毒抗原颗粒的完整性，从而刺激机体产生保护性抗体。关于ASFV灭活疫苗的最新研究是在2014年进行的，用新型现代佐剂对其进行了安全性测试，但是这些方法并没有让接种猪群得到有效保护。Estefania等［11］在低温下用低浓度的二乙烯亚胺（BEI）灭活病毒，联合新的强效佐剂，通过皮内、肌内同时双重接种，4周后用相同剂量和注射方式进行增强免疫，接种6 周后肌肉注射强毒株攻毒，结果所有动物均有ASF的临床症状和病理表现，说明采用灭活疫苗没有对ASFV攻击产生有效保护。ASF灭活疫苗采用了各种新型的保护佐剂，迄今为止研究结果显示ASF灭活疫苗无法提供有效保护，可能是由于病毒表面蛋白差异性很大，不是所有的抗原在失活后还保留完整结构，因此影响了免疫效果，也表明细胞免疫在预防ASFV 中的重要性。而要产生细胞反应，宿主细胞中必然有大量的病毒复制，这为减毒活疫苗的有效性提供了理论基础。

2.2 减毒活疫苗

2.2.1 传统减毒活疫苗 减毒活疫苗毒性明显减少，既保持了原有的抗原性，又诱导体内产生强烈持久的免疫应答，但因其存在毒力返强及病毒变异的问题，极大地限制了该类疫苗的应用。葡萄牙在1962 年启动了非洲猪瘟弱毒疫苗田间试验，结果出现母猪流产、皮肤坏死、关节炎、肺部损伤等慢性感染现象［12-13］。利用从软蜱或者慢性感染猪只体内分离到的天然弱毒株（OURT88/3和NH/P68）而制备的减毒活疫苗（LAV），在接种猪只后可以对同源毒株产生很好的免疫保护，不同的免疫途径、接种剂量、攻毒株会产生不同的保护率［14］。通过非敏感细胞Vero细胞连续传110代致弱的LAV，在免疫猪群后，其体内复制能力降低，毒力逐步丧失，毒力基因的表达能力明显下降，不能抵抗亲本毒株的攻击，也就不能提供有效的保护。

2.2.2 基因工程减毒活疫苗 ASF减毒活疫苗具有毒株特异性，传统天然弱毒及人工培养弱化制备的LAV，其免疫效果差异巨大，包括残余毒力、病毒血症和亚临床症状等，因此越来越多的学者开始研究基因缺失弱毒苗，认为其安全性及可靠性更高。张艳艳等［15］以SY18 为亲本株构建了ASFV MGF 和CD2v 基因缺失疫苗候选株，并对其安全性和免疫保护效果进行了特性研究，结果显示，该双基因缺失株能够抵抗亲本强毒株SY18株的攻击。Elisabeth 等［16］用Ba71 ASFV 毒株基因缺失苗（缺失CD2基因）免疫猪只，能激活免疫系统并产生较强的抗体水平，有效抵抗亲本毒株Ba71 和异源E75 毒株（两种基因型Ⅰ株）的致命攻击。这些结果为将来研发ASFV交叉保护疫苗开辟了新途径，表明基于CD2v 的减毒活疫苗具有较大的开发前景，这对于在病毒流行和多种毒株传播地区的ASFV 防控至关重要。目前ASFV重组致弱活疫苗主要集中于敲除TK、9GL、UK、EP402R、NL、MCF 360/55 基因，可以让病毒毒力减弱且兼具较好的免疫原性。备受关注的哈兽研的非洲猪瘟7 基因缺失减毒活疫苗（ASFV-7GD）已开展相关临床试验，若能通过安全性和免疫原性检测，同时找到稳定的生产细胞系，有可能成为首个商品化ASF疫苗。

2.3 亚单位疫苗 传统亚单位疫苗是将可控蛋白质分解或水解后纯化，进而筛选出具有免疫活性的小分子片段制备成疫苗。因没有病毒核酸，克服了传统减毒活疫苗灭活不完全、毒力返强等问题，安全性更好，但保护效力相对较弱。利用杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒作为病毒载体，能刺激细胞免疫，提供更优秀的免疫保护效率，布局该技术路径的包括普莱柯生物股份、中牧股份等企业。ASFV的CD2v 不是强免疫原性抗原，因此需接种较大剂量的蛋白质才能诱导产生较高的抗体水平。用杆状病毒表达的p54/p30 融合蛋白免疫猪群，可以产生一定量的中和抗体，并在攻毒后改善病程，减少病毒血症的发生，同时保护猪只免受E75 的致命攻击。利用杆状病毒来表达的CD2v/p54/p30 蛋白，在免疫猪群后能产生中和抗体抵抗强毒株的攻击，但会出现不同程度的病毒血症。ASFV 基因组结构庞大复杂，编码蛋白多且容易发生变异，是影响疫苗研发和免疫效果的重要因素之一。p72 蛋白在体外单独表达时容易出现错误折叠，用辅助蛋白B602L 共表达时可得到正确折叠构象的p72 蛋白［17］。将表达ASFV B646L、EP153R、EP402R 的抗原重组痘苗病毒免疫猪只后，能够诱导IFN-γ分泌和T淋巴细胞增殖分化，但不能诱导机体体液免疫应答［18］。

3 展望

伴随经济全球化发展，跨地域的人员和贸易流通加快，养殖密度不断提高，养殖模式越来越多样化等，给ASF 的防控带来更加严峻的挑战，而ASF疫苗的研究历来是一个世界性难题，尽管各国科学家们进行了各种不同的尝试，但由于其基因组结构复杂，免疫逃避机制尚未研究透彻，至今仍无商业化的疫苗上市，给世界养猪业带来了严重的损失和威胁。随着生物学技术的不断发展，以及对ASFV发病机制、免疫逃逸机制等的深入研究，相信在不久的将来，安全、可控的ASF疫苗定会成功问世。