具有定向微孔结构的丝素蛋白导管用于周围神经损伤修复研究与应用进展

万红霞，毛小晓，江津津，王欢，陈庆

（广州城市职业学院食品科学与美食养生学院，广东 广州 510405）

神经系统损伤后的再生修复与功能重建一直是神经科学研究者亟待探索解决的重大课题。 与中枢神经［1］相比，外周神经结构更为简单，且本身具有一定的再生能力，因此其被修复的潜力也更大。 当前，临床上对于周围神经缺损的治疗方法主要分为以下几类：对于短距离的神经缺损，采用显微外科手术将离断的神经对接后进行端对端外膜缝合，可以恢复神经功能；对于更为常见的长距离神经缺损（≥5mm），通常采用自体神经移植或异体神经移植进行治疗。 自体移植是神经修复的“黄金标准”，具有理想的修复效果，但存在供区神经功能受损、取材长度受限、神经粘连、组织坏死等问题，无法满足长距离的周围神经缺损修复［2］。而同种异体神经移植虽然不受取材和距离的限制，却存在伦理争议和免疫排斥的问题［3］。 近年来，人工神经导管的出现为周围神经缺损提供了较好的修复方法，其不受伦理和损伤距离的限制，是周围神经修复的一种重要方式，目前越来越受到人们的关注［4］，具有广阔的应用前景。

丝素蛋白（Silk fibroin，SF）作为一种用于构建人工神经导管的天然高分子材料，是经FDA 批准可植入体内的生物材料，它主要是从家养蚕丝中提取的，具有良好的生物相容性、机械性能且提取方便，免疫原性低，廉价安全，来源广泛［5］。 过去几十年丝素蛋白在周围神经修复中发挥了重要的作用，这种材料可以满足人工神经导管的抗扭结和耐缝合性等特点［6-7］。 而作为早在2001 年便开始应用的定向冷冻技术则使导管凝胶中所形成的微孔结构有沿冷冻温度梯度方向的取向，使导管内壁具有定向排列的微孔，可以起到控制轴突生长分布的特点。 因此，本文对近年来有关具有定向微孔结构的丝素蛋白神经支架的制备方法与对周围神经修复的作用进行分析，指出潜在的不足并对丝素蛋白神经导管的未来临床应用进行展望。

一、丝素蛋白及其衍生物的生物学特性

丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，主要由轻链（26 kDa）和重链（390 kDa）组成，分子链中含有18 中氨基酸，其中大部分是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸［8］。 在溶液中，丝素蛋白以无规则卷曲的构型为主，但在一定外界因素作用下如温度、浓度、pH 值等，无规则卷曲会转变为能量低且结构稳定的β-折叠构象［9］，这些结构使SF具有良好的机械性能和优异的生物相容性，可以与新生组织形成相匹配的速度进行降解，从而有利于组织再生和细胞外基质的沉淀。

研究表明，丝素蛋白具有以下几个特性：（1）良好的生物相容性。 丝素蛋白作为一种天然高分子物质，具有良好的生物相容性。 Hu 等［10］通过静电纺丝制备了一种丝素蛋白纤维支架，发现其能够促进雪旺细胞的粘附、生长和增殖，具有良好的生物相容性。 （2） 有利于促进组织再生。 Wei等［11］使用分光光度法和扫描电子显微镜分析丝素蛋白结构和功能，首次在体外评估了丝素蛋白水凝胶神经导管对活细胞的活性、生长的影响，并通过动物实验模型测定其是否具有增强神经再生的潜力，结果是积极乐观的；Gu 等［12］使用由丝素和壳聚糖制备并经过雪旺细胞种植的人工神经导管修复周围神经缺损，结果显示该神经导管的再生修复效果接近自体神经移植，表明该神经导管具有良好的促进外周神经损伤后修复与再生的能力。 （3）孔隙率高和良好的生物降解性。 Meinel等［13］分别以丝素蛋白和胶原为原料制成软骨修复支架，研究不同支架骨髓间充质干细胞（hMSC）黏附、增殖、代谢等行为的影响，研究发现hMSC 在缓慢降解的SF 支架上的黏附、增殖和代谢活性明显优于在快速降解的胶原支架上，而且hMSC 在SF支架上成软骨程度比胶原支架更高，这是因为SF支架具有高孔隙度、缓慢的生物降解和结构完整性的缘故。 （4）具有抗炎、抗氧化以及止血等性能。 Rodriguez-Nogales 等［14］构建了一种RGD 修饰的丝素纳米颗粒（RGD-SFNs）用于炎症性肠病的治疗，结果显示SFN 治疗改善了结肠损伤，减少了中性粒细胞浸润，改善了结肠受损的氧化状态；RGD-SFNs 处理的大鼠显著降低促炎细胞因子（IL-1β，IL-6 和IL-12）和诱导型一氧化氮合酶的表达，具有明显的肠道抗炎特性。 Passi 等［15］通过实验发现SF 纳米颗粒可以有效减少过氧化氢介导的氧化应激引起的ROS 水平升高；Wei 等［16］通过构建肝脏损伤的动物模型得出SF 可有效止血的结论。 总而言之，这些研究表明SF 蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

二、具有定向微孔丝素蛋白支架的制备方法

神经导管是由天然的或者人工合成材料制成的具有特定立体结构和生物活性的管状结构，可将断裂神经的远端残端和近端残端连接起来，承担桥接体的角色并起到引导神经生长的作用。 神经导管的结构在神经修复中发挥重要的作用，在神经导管中引入拓扑结构已经被证明具有良好的促进神经修复效果，目前对于神经导管的内部结构的设计多为模仿天然神经的束状解剖结构，在神经导管内部构建定向的有序孔道，例如沟槽型结构、填充型结构、多通道型结构等，这些结构可以为细胞运动和迁移提供引导，促进雪旺细胞的黏附和增殖，有利于轴突的再生。 因此，在神经导管中引入具有方向性的拓扑结构被越来越多的研究者关注。

对于丝素蛋白基神经导管，通过梯度冷冻，冷冻干燥，颗粒沥滤或气体泡沫作用的方法均可使丝素溶液形成三维多孔的海绵状支架［17］。 为了赋予丝素蛋白支架良好的定向微孔结构，在原来冷冻干燥方法的基础上，利用定向冷冻的方法构建定向结构。 定向冷冻法目前已经被广泛运用在仿生多孔结构材料和组织工程中，简单来说，就是将混合溶液在固定的方向上进行冷冻，从而将溶质在晶层间沿着一定的方向生长多孔排列的结构，定向的微孔结构可以促进神经轴突朝着指定的方向进行生长，为神经再生提供拓扑结构引导。 定向冷冻技术能够形成微通道结构，该结构能够提供形貌和物理线索，可以较好地模拟神经内膜管的微通道。 Rao 等［18］使用定向梯度冷冻技术构建了具有沿中轴纵向排列孔道的导管。 Hibbitts等［19］开发出了一种快速冷却冷冻工艺，使得所形成孔道的结构与排列最适合轴突的再生。

在定向冷冻技术中，通过温度梯度提供定向效果较为常用。 梯度冷冻可以使导管凝胶中所形成的微孔结构有沿冷冻温度梯度方向上的取向。这样制备出来的基质具有大量排列整齐的微孔，这些微孔可以控制轴突的分布和定向生长。 具体技术过程是将金属（不锈钢或铜等）制成的板置于液氮中，再将装有导管溶胶材料的模具置于金属板上，这样上下温度不均一，形成了温度上的梯度，导管溶胶中溶剂冻结的方向是单向的，冰晶将在特定的方向上生长，从而形成单向气孔。 如Zhang 等［20］利用温度梯度定向冷冻技术构建了具有定向多孔道结构的丝素蛋白支架，与无定向结构的丝素蛋白支架相比，具有定向多孔道结构的丝素蛋白支架能够显著促进海马神经元轴突沿多孔道方向定向生长。 Asuncion 等［21］利用温度梯度定向冷冻技术制备了丝素蛋白-明胶复合支架，发现BMSCs 在普通冷冻支架上散乱生长，而在定向冷冻支架上沿定向孔道生长。 Bhardwaj 等［22］以丝素蛋白作为原料，联合梯度冷冻凝胶法制备了SF多孔结构的支架，研究结果发现与传统的冷冻干燥法相比，该技术制备的支架具有分布更均衡、极性更强、连通性更优的微孔，且孔隙率可达90%。

三、具有定向微孔结构的丝素蛋白支架对神经细胞行为和功能的影响

（一）对神经元细胞黏附、迁移、增殖的影响

接触引导理论认为，神经的连通性很大程度上取决于生长中的再生轴突朝向其真正目标的方向性。 如果再生轴突不能成功适当伸长，神经就不会成熟，导致其长期退化和功能丧失。 引导神经轴突延伸和神经元分化的一种有效方法是通过创建高度有序的微／纳米结构表面形貌，在细胞水平上提供物理支持和引导。 先前很多研究表明，神经细胞能够对许多取向结构产生响应，如通道和微沟槽形式的取向结构能够显著增强细胞排列和神经轴突生长。 Shula 等［23］使用定向冷冻法制备了具有单轴线性孔的神经引导支架，该支架可促进PC12 细胞神经轴突生长。 Zhang 等［24］制备了具有定向脊和负载生物活性分子的多通道／层粘连蛋白丝素支架，研究发现再生轴突在通道方向上以有组织和线性的方式分布。 这些研究表明，具有特殊定向通道的神经引导导管对于神经损伤修复中轴突的延伸具有重要意义。

神经修复支架的微孔尺寸也会对神经细胞的行为产生影响。 理论上，为引导轴突再生而创建的支架应该具有足够小的孔，以物理对齐和限制轴突生长的方向，但又足够大以允许血管形成和支持再生的细胞浸润。 例如，Christopherson 等［25］发现纳米拓扑结构的尺寸会影响神经元干细胞的分化；材料表面脊／沟图案阵列可有效诱导人胚胎干细胞分化为神经元谱系，而无需使用任何分化诱导剂。 这可能是因为在拓扑结构引起的细胞形态变化期间，细胞骨架的伸长导致张力传递到细胞核，影响基因表达和信号转导［26］。 此外，也有研究表明纳米拓扑结构可以通过细胞骨架在细胞膜和核膜之间通过机械耦合使细胞核在纳米尺度上变形，从而调节细胞行为［27］。 对于周围神经修复用导管，基于神经的结构特点，仅仅提供定向通道或脊／沟模式是不够的，具有特殊定向多通道的支架将具有更大的神经再生潜力。 有研究表明具有单向排列多孔微结构的丝素蛋白支架可以有效调节神经元细胞的行为，促进神经元分化［28］。

（二）对雪旺细胞成髓鞘的影响

雪旺细胞（SCs）在周围神经损伤后的轴突再生和修复中起着重要作用。 有研究发现，负载神经营养因子和血管内皮生长因子的丝素蛋白支架能够促进小鼠模型中SCs 的定向生长、增殖和扩散，以及周围神经再生和新生血管形成［29］。 此外，用静电纺丝法制备的具有定向纤维结构的丝素蛋白支架也被证实了可以有效促进雪旺细胞的粘附、增殖和迁移，并且能通过神经突形成复杂的神经网络系统，从而帮助引导轴突的再生［30］。 Wang等［31］利用静电纺丝技术构建了丝素蛋白／聚左旋乳酸己内酯纳米纤维支架，研究其在4 周和8 周时对大鼠坐骨神经10 mm 缺损的修复效果，对再生神经进行电生理评估、组织学和免疫组织学分析，结果发现具有平行排列结构的纳米纤维支架具有更好的再生神经功能恢复且再生神经更为成熟，雪旺细胞髓鞘化程度更高。

在病理生理学上，当周围神经发生损伤时，轴突会出现损伤，雪旺细胞与远端残端失去了接触而出现脱髓鞘。 此时，雪旺细胞会大量增殖并定向排列，成熟后的雪旺细胞膜作为髓鞘的组成部分，为轴突的再生提供空间，从而促进轴突的伸长。 有关背根神经节外植体的研究也发现，轴突的成熟与DRG 外植体中髓鞘的形成有关［32］。 丝素蛋白支架表面功能化各向异性微纳拓扑结构可通过Apelin 通路进一步激活PI3K-Akt 和磷脂酰肌醇信号通路，通过级联反应促进SCs 的增殖、分化以及促进SCs 的取向和DRG 的轴突延伸［33］。 这些研究均显示，具有定向微孔结构的丝素蛋白支架在募集雪旺细胞，促进雪旺细胞成熟、成髓鞘方面具有优异的表现，表明了具有定向微孔结构的丝素蛋白神经导管在周围神经修复领域上具有较好的应用潜力。

四、展望

综上所述，丝素蛋白是一种制备神经导管的合适材料，能够为周围神经损伤修复提供优良桥接体。 但是，单一的丝素蛋白材料存在降解速度慢的问题，通过将丝素蛋白与其他天然高分子或者合成高分子材料复合可以调节丝素蛋白在体内的降解速度，使其与组织再生速度相匹配，所以将丝素蛋白与其他材料复合成为神经导管材料研究的热门，如将丝素蛋白与胶原复合，构建胶原／丝素蛋白导管有望成为未来修复周围神经损伤的理想人工神经导管。 同时，为了提高丝素蛋白支架的促神经再生能力，对丝素蛋白进行表面功能化修饰如RGD 修饰等，或负载神经细胞因子、富血小板血浆（PRP）、外泌体等，或者通过复合压电材料、导电材料赋予丝素蛋白神经导管良好的电活性，这些方法都可以有效提升丝素蛋白神经导管的促周围神经修复的能力。 此外，对于丝素蛋白基导管的内部结构的仿生化构建依然是一个研究的重点，选择不同分子量和不同超微结构的丝素蛋白，利用定向梯度冷冻技术并联合物质填充、纳米纤维仿生技术、静电纺丝技术、3D 打印技术等改善神经导管结构，最大限度还原组织再生的微结构，促进神经细胞黏附和定向迁移以及引导神经轴突定向生长，改善再生神经的功能，从而构建具有良好修复效果的功能化神经导管。 这样的导管市场应用前景广阔，可缓解我国神经修复材料严重不足和部分依赖欧美进口的局面。