淡水与海水养殖的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)幼鱼的生长、生化指标和消化酶活力的差异

陈微佳，李福学，张思鹏，陈燕婷，戴燕彬，黄洪龙，尤颖哲，陈武各

(1.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102；2.福建省水产技术推广总站，福建 福州 350002；3.漳州市水产技术推广站，福建 漳州 363000；4.漳浦县兴海水产养殖有限公司，福建 漳州 363000)

鱼类的活动与生理功能受内部(神经、内分泌)和外部(生态)因素调控[1]。许多研究已经证实了环境盐度对鱼类的生长发育具有重要的影响[2-4]。鱼类可以通过调控非特异性免疫酶、抗氧化酶和钠-钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)活性来抵御盐度胁迫损害[5]：抗氧化酶能够清除鱼体内由应激反应产生的过量氧自由基，减轻氧化损伤，增强鱼体的免疫功能[6]；Na+/K+-ATPase参与细胞内Na+和K+主动跨膜运输，是衡量鱼类调节渗透压以维持体内外平衡的主要指标，其中广盐性鱼类能够通过消耗能量来调节体内离子含量[7-8]。消化酶活性则代表了鱼类对营养物质的消化吸收能力，而盐度能够影响脂肪酶等消化酶的活性[9]。

暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鲀科(Tetraodontidae)，是江海洄游性鱼类，具备肉质鲜美、生长快速、经济效益高等优点，作为经济鱼类的开发利用前景十分广阔[10]。近年来，有关其种质资源[11]、生理特性[12-13]和加工方式[14-15]的研究均有报道。在短期盐度胁迫对暗纹东方鲀个体生长发育和生理生化指标的影响研究中发现，暗纹东方鲀幼鱼的发育和鳃丝、肝脏组织的Na+/K+-ATPase活性受盐度变化的影响显著[16]。对不同盐度胁迫处理的暗纹东方鲀个体的监测(为期50 d)结果表明，高盐度对暗纹东方鲀生长、特异性免疫和抗氧化酶活性均有显著影响[17]。

本研究对淡水与海水养殖的暗纹东方鲀个体生长指标进行为期87 d的监测，实验终末时，测定个体血清中溶菌酶(Lysozyme，LZM)、谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetictransaminase，GOT)、谷丙转氨酶(Glutamic pyruvictransaminase，GPT)活性和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，肝脏肠道组织中非特异性免疫酶、抗氧化酶及消化酶活性，肌肉灰分、粗脂肪和粗蛋白含量。实验结果旨在明确淡、海水养殖对暗纹东方鲀生长、生理指标的影响，为其规模化健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2021年7月，从福建省漳州市漳浦县兴海水产养殖有限公司获得当年自行繁育的暗纹东方鲀幼鱼约100尾。实验投喂饲料为广东恒兴饲料实业股份有限公司生产的海水鱼配合饲料(粗蛋白质≥41.0%、粗纤维≤4.0%、粗脂肪≥6.0%、粗灰分≤15.0%、总磷为0.8%～2.0%、赖氨酸≥2.4%、水分≤11.0%)。实验养殖用水为曝气24 h以上的淡水(盐度为0)及经二级砂滤的海水(盐度为30)。实验于厦门大学翔安校区实验室开展，实验所用养殖池为2个相同容积的养殖池(>500 L)，各配备水体自循环装置。

1.2 实验设计与日常维护

将暗纹东方鲀幼鱼随机分为淡水和海水2个养殖组，每组约50尾，分别置于淡、海水池中养殖，少量投喂饲料，驯化30 d(连续10 d无个体死亡)后开始进行正式实验，此时淡水组个体为38尾，海水组个体为43尾。实验期间，养殖池水温为(25.0±1)℃，淡、海水盐度分别为0和(30±1)。每日9：00、18：00投喂饲料，并少量多次以确保没有饲料残余，每次投喂至实验个体表观饱食为止并分别记录淡、海水组饲料投喂量。为维护水质，每日用虹吸方法进行一次池底清污、每周更换二分之一养殖水体，约每10 d测量全部暗纹东方鲀个体的体长和体质量(受疫情影响，测定时间间隔不一致)。

1.3 取样和样品制备

血清生理指标测定：养殖实验结束前24 h停止投喂饲料，分别转移2组全部暗纹东方鲀个体至洁净的塑料桶中，桶中装有50 L原养殖池中的养殖用水，添加丁香酚(终浓度为60 mg·L-1)麻醉个体。5 min后，捞出暗纹东方鲀个体，用生理盐水清洗后置于冰盘上进行解剖，以2 mL注射器从个体心脏取血，低温低速离心(4℃、3 000 r·min-1、10 min)取血清。样品于4℃中保存,备用。

肌肉生化指标测定：心脏取血后立即取肝组织和肠道样品，将附着物去除后用生理盐水冲洗并用滤纸轻轻吸干，用灭菌处理的剪刀和镊子取样品并迅速称重，-80℃保存备用，用于测定肝脏和肠道的生理指标。用灭菌解剖刀剥离鱼皮后剪取背部肌肉样品，生理盐水冲洗后用滤纸吸干水分，称重并保存于-80℃，待测。

酶活性等生理指标测定：按试剂盒说明书中的样品制备要求，用超声波细胞粉碎机(XINYI-ⅡD，信仪)制备肝组织和肠道样品匀浆液，低温离心机(5425R,Eppendorf)3 000 r·min-1、4℃离心20 min，取上清液，于4℃保存,待测。

1.4 测定指标与测定方法

1.4.1 生长性能指标与饲料利用率

体长日均增长量(Average daily gain in body length，DLG)、体质量日均增长量(Average daily gain in body mass，DWG)、体长相对增长率(Relative growth rate of body length，RL)、体质量相对增长率(Relative growth rate of body mass，RW)、体长特定增长率(Specific growth rate of body length，SGRL)、体质量特定增长率(Specific growth rate of body mass，SGRW)、肥满度(Condition factor，CF)、饲料利用率(Efficiency of feed utilization，EFU)、存活率(Survival rate，SR)等指标的计算公式为：

DLG(cm·d-1)=(L2-L1)/(t2-t1)

(1)

DWG(g·d-1)=(W2-W1)/(t2-t1)

(2)

RL(%)=(L2-L1)/L1×100

(3)

RW(%)=[ (W2-W1)/W1]×100

(4)

SGRL(%·d-1)=[(lnL2-lnL1/(t2-t1))]× 100

(5)

SGRW(%·d-1)=[ (lnW2-lnW1)/(t2-t1)]×100

(6)

CF(g·cm-3)=W/L3× 100

(7)

EFU(%)=(W2-W1)/c×100

(8)

SR(%)=Nt/N0×100

(9)

式中，c为每实验鱼投喂的饲料总量(g)；L为实验鱼体长(cm)；W为实验鱼体质量(g)；W1、W2和L1、L2分别为t1、t2时的鱼的体质量(g)和体长(cm)；Nt为终末鱼数量(尾)；N0为初始鱼数量。

1.4.2 血清生理指标、非特异性免疫酶与消化酶指标

血清生理指标包括GPT、GOT、LZM活性和MDA含量；肝组织生理指标包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、Na+/K+-ATPase、过氧化氢酶(Hydrogen peroxidase，CAT)的活性及总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)；消化酶指标包括糜蛋白酶(Chymotrypsin，SA)和肠脂肪酶(Lipase，LSP)活力。肝组织生理指标、血液生理指标、组织蛋白质含量和消化酶活性测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，实验操作和计算方法严格按照试剂盒说明书进行，采用分光光度计(普析TU-1810)或单功能酶标仪(SpectraMax ABS Plus，MOLECULAR DEV ICES)测定数据。

1.4.3 肌肉生化组分指标

测定暗纹东方鲀幼鱼肌肉的粗蛋白质含量(凯氏定氮法， GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》)、粗脂肪含量(索氏抽提法， GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》)和粗灰分含量(高温灼烧法， GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》)。

1.5 数据处理与统计

用SPSS 22处理数据，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用协方差分析(ANCOVA)，以初始体长、初始体质量为协变量比较实验期间暗纹东方鲀幼鱼体长、体质量变化组间差异性(P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著)；采用t检验(t-test)比较组间生长指标、血液生理指标、肝组织生理指标和消化酶活性(P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著)。

2 结果与分析

淡水与海水养殖的暗纹东方鲀幼鱼在实验期间(87 d)生长状态均良好，实验结束时个体存活率高，其中，淡水组幼鱼存活38尾，个体存活率为100%；海水组幼鱼存活42尾，死亡1尾(养殖过程中因意外吸入下水口而受伤，并最终死亡)，个体存活率为97.73%。

2.1 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼生长与饲料利用率的影响

统计分析结果表明，淡水组与海水组暗纹东方鲀幼鱼初始体长无显著差异(P>0.05)，至实验结束时，淡水组幼鱼的平均体长增长极显著大于海水组(P<0.01)；初始体质量无显著差异(P>0.05)，至实验结束时，淡水组幼鱼平均体质量增长极显著大于海水组(P<0.01)(表1)。淡水组幼鱼体长日均增长量、体质量日均增长量、体长相对增长率、体质量相对增长率、体长特定增长率、体质量特定增长率和肥满度7个生长指标均极显著高于海水组(P<0.01)；淡水组幼鱼的总饲料利用率高于海水组(表1)。综上，幼鱼生长指标的监测结果表明，淡水养殖的暗纹东方鲀幼鱼生长情况优于海水组，个体的生长发育速度也显著快于海水组。

表1 淡、海水养殖暗纹东方鲀幼鱼的生长性能与饲料利用率

淡水组与海水组暗纹东方鲀幼鱼组间体长和体质量的差异随养殖时间增加而逐渐增大，组内幼鱼个体之间生长发育差异也逐渐增大(图1)。淡水组与海水组之间个体体长平均数之差和体质量平均数之差与养殖时间分别存在极显著的正相关关系(图2，体长r1=0.827,P<0.01；体质量r2=0.994，P<0.01)，且养殖时间越长，组间生长差异越大。暗纹东方鲀幼鱼的体长和体质量的增长都极显著受到养殖水盐度的影响。

2.2 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼血清生理指标的影响

淡水组与海水组暗纹东方鲀幼鱼血清的GPT和GOT活性无显著差异(P>0.05)；淡水组暗纹东方鲀幼鱼LZM活性显著高于海水组(P<0.05)；MDA含量在淡水组与海水组之间无显著性差异(P>0.05)(表2)。

2.3 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼肝组织生理指标的影响

淡水组暗纹东方鲀幼鱼的Na+/K+-ATPase酶活力显著低于海水组(P<0.05)，此外，淡水组与海水组幼鱼的SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT活性在组间均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 养殖水体盐度对暗纹东方鲀幼鱼肝组织生理指标的影响

2.4 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼消化酶活力的影响

淡水组与海水组的暗纹东方鲀幼鱼个体糜蛋白酶和肠脂肪酶的活性在组间均无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 养殖水体盐度对暗纹东方鲀幼鱼消化酶活性的影响

2.5 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼肌肉生化组分的影响

淡水组暗纹东方鲀幼鱼肌肉的粗蛋白、粗脂肪含量略高于海水组，粗灰分则略低于海水组，但这一差异不具有显著性(P>0.05)(表5)。

表5 养殖水体盐度对暗纹东方鲀幼鱼个体肌肉一般营养成分的影响

3 讨论

3.1 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼生长指标的影响

鱼类的生长发育显著受到水环境盐度的影响[18]。对金钱鱼(Scatophagusargus)[19]、珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)[20]、四指马鲅(Eleutheronematetradactylum)[21]、多鳞(Sillagosihama)[22]的研究结果指出，个体生长发育速度随盐度升高而降低。边平江等的研究结果表明，在盐度为24～30的处理组中，暗纹东方鲀个体生长受到较大抑制[17]，这与本研究结果一致：淡水养殖组幼鱼多个生长指标极显著高于海水组(P<0.01)，盐度对暗纹东方鲀的发育具有极显著的影响。肥满度是评价鱼类营养状况的重要指标，个体肥满度越高，其体内储存的营养能量物质越多[23]。本研究中，淡水组幼鱼肥满度极显著高于海水组(P<0.01)，这表明淡水组幼鱼的营养物质积累与储备显著优于海水组，从养殖经济效益的角度看，淡水组幼鱼的饲料利用率高于海水组也可证明淡水养殖暗纹东方鲀的饲料投喂成本更低。综合以上表观生长指标的监测结果，淡水养殖的暗纹东方鲀幼鱼生长情况更好，个体的生长发育速度显著快于在海水养殖。

3.2 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼血清生理指标的影响

GOT、GPT等转氨酶一般存在于肝脏细胞中，在环境胁迫下，动物发生肝损伤会大量释放转氨酶于血液之中，导致血液中转氨酶活性升高[24]。MDA是生物体内脂质过氧化的终产物，其含量是指征机体抗氧化能力的重要参数，能够反映机体脂质过氧化速率、强度和氧化损伤程度[25]。本研究中，淡、海水养殖的暗纹东方鲀幼鱼血清中GOT、GPT活性和MDA含量均无显著性差异(P>0.05)，说明经过87 d海水养殖的幼鱼已适应了高盐环境，肝脏等组织器官生理状态正常。

LZM是一类能够水解黏多糖的碱性蛋白酶，可以破坏和消除进入体内的异物，是机体免疫调节能力的指标[26]。本研究中，淡水组暗纹东方鲀幼鱼血清的LZM含量显著高于海水组(P<0.05)，即海水组幼鱼的机体免疫调节能力差，这与边平江等的研究结果一致：在盐度30的水体中养殖天数超过40 d的暗纹东方鲀LZM含量显著低于淡水养殖组[17]。

3.3 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼肝组织生理指标的影响

动物体内代谢产生活性氧(ROS)，包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)等[27]。ROS在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，多余ROS会导致氧化应激反应，诱导蛋白质、脂质和DNA氧化损伤，造成细胞凋亡[28-29]。SOD、CAT、T-AOC和GSH-Px是抗氧化系统中清除多余活性自由基的重要抗氧化酶。本研究中，暗纹东方鲀幼鱼的淡、海水处理组之间CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px活力均无显著性差异，因此，淡、海水养殖对鱼体的抗氧化能力无显著影响，这与血清中表征抗氧化能力的MDA含量测定结果一致。本研究结果与边平江等的研究结论相似：当盐度为30、养殖时间大于40 d时，暗纹东方鲀肝脏中抗氧化酶的活力恢复至与淡水组水平相当[17]，这可能是长期适应的结果。

Na+/K+-ATPase是生物体内离子调节过程中的关键酶，其功能是保持细胞内高K+、细胞外高Na+的离子浓度梯度平衡。本研究中，海水组暗纹东方鲀幼鱼的Na+/K+-ATPase活性显著高于淡水组(P<0.05)，即为了维持高渗环境下鱼体的水-盐平衡，使内环境稳定，鱼体Na+/K+-ATPase活性增强。这一结果与先前对刀鲚(Coilianasus)[30]、罗非鱼(Oreochromissp.、Sarotherodonmelanotheron、O.niloticus)[31]、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[32]和黄河鲤(Cyprinuscarpiohaematoperus)[33]的研究结果相似。本研究中，淡水养殖的暗纹东方鲀幼鱼生长指标显著优于海水养殖，可以推测：在高盐环境中，广盐性鱼类需要更多的能量用于维持渗透压平衡，引起分配到生长的能量减少，从而使其生长受到抑制。

3.4 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼消化酶活力的影响

鱼类消化酶活性是反映个体基本消化生理特征及其对营养成分的利用能力的重要指标[34]。对于广盐性鱼类而言，消化酶活力受盐度影响变化较为复杂，不同物种、年龄的个体之间也存在差异[5,30,35-37]。一项为期14 d的研究结果表明，将0龄暗纹东方鲀从淡水转移至盐度为30的海水后，个体胃蛋白酶活性随适应时间的延长而升高，而后回落的趋势；胰蛋白酶和淀粉酶则随适应时间的延长有升高的趋势[38]。本研究中，淡、海水环境下分别培养的暗纹东方鲀幼鱼肠脂肪酶和糜蛋白酶活性均无显著性差异(P>0.05)。因此，本研究的结果可能是经长时间养殖的幼鱼均已适应各自养殖环境导致的。此外，一项对黄条(Seriolaaureovittata)个体的生理研究表明：以12 h为间隔的盐度渐变处理下，黄条肠道的肠脂肪酶和蛋白酶活性随盐度的增加而逐渐升高，当盐度为29时达到最高值，显著高于盐度为5的处理组[39]，这与本研究的结果不一致，可能是消化酶活性在不同物种之间的差异导致的。结合生长指标在淡、海水之间的显著差异，可以推测：暗纹东方鲀在不同处理组之间的生长差异是由摄入营养物质后，对能量的分配方式不同导致的，而非获取能量的能力存在差异。

3.5 淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼肌肉生化组分的影响

鱼类肌肉的营养成分与其所生存的水环境密切相关，养殖水体盐度的变化可能改变鱼类肌肉中粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量[40-41]。本研究中，暗纹东方鲀幼鱼肌肉的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量在淡、海水组间均无显著性差异(P>0.05)，这与对消化酶的检测结果一致，即长期适应后，盐度对个体吸收和消化脂肪与蛋白质的能力没有显著的影响，淡、海水组幼鱼对能量的摄取能力没有显著的差异，由于海水组幼鱼需优先分配更多能量用于调节渗透压，维持生存，因此其生长发育速度较淡水组更为缓慢。

4 结论

淡水养殖的暗纹东方鲀幼鱼生长指标与免疫能力显著优于海水养殖，不同盐度下Na+/K+-ATPase渗透压调节的耗能可能是影响暗纹东方鲀幼鱼生长差异的主要因素。为期87 d的培养后，淡、海水养殖对暗纹东方鲀幼鱼抗氧化能力、消化能力，以及其肌肉的粗脂肪、粗蛋白和灰分含量均无显著的影响。因此，相较于海水养殖，淡水养殖更有利于暗纹东方鲀的生长。实验结果对暗纹东方鲀的淡化养殖具有较好的指导意义。