滇金丝猴毛首线虫分子鉴定及其ITS序列分析

张誉方，张国春，谢昕言，杨建发，刘永张，贺君君

（1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.昆明动物园，昆明，650021）

滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）又称云南仰鼻猴，是一种仅在我国滇川藏地区分布的特有物种，喜群居生活，常在海拔2 000 m 以上的高山上活动，数量稀少，被列为我国一级保护野生动物。滇金丝猴常在地面进食，再加上动物园中圈养使其活动范围受限导致抵抗力下降，若不及时打扫清理粪便以及居住场所，很容易被寄生虫感染。临床上，圈养灵长类动物对胃肠道寄生虫较为敏感，尤其以毛首线虫（Trichurisspp.）感染率高［1］。毛首线虫是具有临床重要性、高度土壤传播流行性的4 种人类寄生蠕虫之一，常寄生于猪、狗等哺乳动物，1771 年发现毛首鞭形线虫（Trichuristrichura）可感染人与灵长类［2］。基于形态学和宿主物种，目前大约有100 种毛首线虫被确认［3］。为达到保护野生动物、持续利用野生动物资源的目的，越来越多的滇金丝猴被人工饲养［4］，与此同时，圈养滇金丝猴之间、人和滇金丝猴之间的接触更为密切，可能存在毛首线虫交叉感染风险，从而引发人兽共患。

国内对于毛首线虫病（Trichuriasis）的相关报道多以圈养金丝猴为研究对象，谢翔［5］和郑延益［6］分别对福州动物园和贵阳森林野生动物园的动物进行寄生虫感染情况调查，其中灵长类毛首线虫的感染率分别为31%和75%；贾婷等［7］采用形态学和分子生物学方法对北京动物园圈养的滇金丝猴等3 种金丝猴进行了寄生虫普查，发现毛首线虫感染严重。其他国家和地区如越南也有关于黑腿白臀叶猴（Pygathrix nigripes）感染毛首线虫的报道［8］，大多集中在感染率和形态学鉴定，分子生物学的相关研究很少。

本研究基于ITS 序列对来自云南某动物园滇金丝猴体内分离获得的线虫进行DNA 的提取和PCR 扩增，分析基因序列并结合形态学鉴定种属，对寄生虫病防控进行科学指导，并为滇金丝猴体内线虫的鉴别诊断、种群结构的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2022 年1 月收到来自云南某动物园送检的滇金丝猴肠道线虫，虫体经灭菌生理盐水洗净后置于70%乙醇中保存，待用。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

用生理盐水将虫体样品清洗干净，利用解剖显微镜观察虫体样品的形态学结构，拍摄虫体照片，进行初步形态学鉴定。毛首鞭形线虫的形态学特征：虫体前部和后部之比为3∶2，整个虫体如鞭状，雌虫的阴门开口于虫体粗细交界处，雄虫尾部向背面卷曲，有1 根交合刺［9］。鉴定完毕后，样品保存于装有70%乙醇的玻璃瓶中备用。

1.2.2 分子生物学鉴定

样品DNA 制备：从70%乙醇保存液中取出4 条单个虫体，用双蒸水反复冲洗3次后，各虫体分别取 1 cm，置于1.5 mL离心管中，命名为1、2、3、4；用灭菌的微型剪刀将虫体组织剪碎，反复研磨，参考DNA提取试剂盒（粪便DNA 提取试剂盒购自天根生物科技有限公司）说明书提取4条虫体DNA，DNA 样品置于冰箱-20 ℃保存备用。

PCR 扩增ITS 序列：参考Luton 等［10］报道的 引物，扩增此线虫的ITS 序列，预期扩增的目的片段大小约为1 200 bp，上游引物BD1（5'-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3'，20 bp），下游引 物BD2（5'-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3'，20 bp），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应扩增体系为50 µL：上、下游引物各2 µL，模板DNA

2 µL，双蒸水19 µL，2×PCR MasterMix 25 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；最后72 ℃延伸 5 min，16 ℃结束反应，同时设阴性对照。取5 µL PCR 产物进行1%TAE 琼脂糖凝胶电泳，用GelStain核酸染料染色，以DL2000 DNA Marker 作为参照，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。

1.2.3 ITS基因部分序列测定及系统进化树构建

将阳性PCR 产物送测序公司双向测序，拼接测序结果，并于NCBI进行BLAST在线比对分析。利用MEGA 6.0软件构建进化树，以有齿食道口线虫（Oesophagostomumdentatum）为外群，方法为相邻法，Bootstrap置信值重复抽样1 000次。

2 结果

2.1 形态学观察

虫体长26.0～30.0 mm，前部细长，后部明显短粗，显微镜下观察到雌虫的阴门位于虫体前后交界处（图1A），雄虫有交合刺1 根（图1B），经反复对照文献和寄生虫形态分类图谱［9］，结合虫体照片，依据其形态初步确定为毛首线虫（Trichurissp.）。

图1 滇金丝猴毛首线虫的显微镜观察结果Fig.1 The results of the microscopic observation of Trichuris sp.

2.2 PCR扩增结果

经PCR 扩增，4 条虫体样品成功扩增出长度为 1 240、1 240、1 240、1 238 bp 的基因片段，与预期ITS基因目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性（图2）。

图2 滇金丝猴毛首线虫ITS序列的PCR扩增产物Fig.2 PCR amplification of partial ITS sequences from the Trichuris sp.

2.3 ITS基因部分序列及系统进化树

BLAST 比对结果显示，样品与毛首线虫（Trichurissp.）相似度高达99.05%。由图3 可见，4 条线虫样品分离株与GenBank 中检索到的登录号为MN447324.1和KT186232.1来自中国的虫株并入同一分支，表明这4 个样品分离株与来自中国的川金丝猴（Rhinopithecusroxellana）和叶猴（Presbytissp.）体内分离出的虫株亲缘关系最近；同时，4 个样品与登录号为AM992995.1 和AM992996.1 来自中国成年人感染的毛首线虫种汇在同一个大的分支，进而与登录号为GQ301551.1 和GQ301553.1 来自南非的阿拉伯狒狒（Papio hamadryas ursinus）感染的毛首线虫种汇于一大分支；而来自非人灵长类和啮齿类2种宿主的序列按照宿主分别汇成分支，呈现出不同的宿主分化趋势。

图3 基于ITS构建的毛首线虫种系发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on Trichuris sp.ITS sequences

3 分析与讨论

毛首线虫又称鞭虫，是一种呈世界性分布的多宿主寄生虫，灵长类动物对毛首鞭形线虫［11］、猪鞭虫（Trichuris suis）［12］、羊鞭虫（T.ovis）［13］、皮翼毛首线虫（T.cynocephalus）以及川金丝猴毛首线虫新种（Trichocephalus rhinopiptheroxella）［14-15］易感，但不同的灵长类动物对毛首线虫的感染率不同［16］，感染后常表现为食欲不振、生长不良、顽固性腹泻等症状，且粪便呈黑褐色水样；人类尤其是儿童对于T.trichiura、T.suis［17］表现为易感，发病时通常表现为精神沉郁、营养不良、生长迟缓、肠系膜异位症［18］及肠炎等［19］。

人类活动范围的扩大不仅让金丝猴的生存环境被破坏，同时也带来了更多的疾病，尤其是寄生虫病严重威胁着灵长类动物的健康［20］。毛首线虫病不仅严重威胁灵长类动物的机体健康，且存在人兽共患及交叉感染风险，容易造成严重的公共卫生事件，因此有关灵长类动物的毛首线虫感染报道还需更完善深入地调查和研究。

3.1 案例回顾

本研究中，该滇金丝猴生前食欲废绝，精神沉郁，顽固性腹泻，粪便呈黑褐色水样，血液检查有贫血症状［21］；剖检见部分肠黏膜组织脱落，结肠黏膜出血性坏死，这与文献报道感染毛首线虫的临床症状［22］基本一致，由此推测感染了毛首线虫；显微镜下观察肠道内成虫虫体前部细长，后部明显短粗，雌虫的阴门位于虫体粗细交界处，雄虫具有1 根交合刺，所观察虫体形态学与寄生虫图谱［9］中对于毛首线虫的描述一致，初步鉴定为毛首线虫。线虫ITS 序列分析结果显示样品与毛首线虫相似度最高，达99.05%，最终判定这只滇金丝猴感染了毛首鞭形线虫。

3.2 原因分析

灵长类动物对毛首线虫极为敏感，感染率高达80%以上，严重可引起发病甚至死亡［23］，且存在重复感染现象［24］。作为土源性寄生虫，毛首线虫不需要中间宿主，在盲肠产出的虫卵随着宿主粪便排出体外并污染周围土壤，易感动物通过接触被污染的粪便或土壤经口感染。进入宿主体内的虫卵会在小肠发育成幼虫，进入肠黏膜摄取营养，一段时间后重新回到盲肠段发育成成虫［25-26］。由于灵长类动物是群居动物，误食毛首线虫卵后，通过一起玩耍、进食、抱团等形式，极易增大毛首线虫病的传播和感染概率［27］。

本研究中，滇金丝猴发病距开始救助的时间较长，推测有可能是在园区内误食了携带有感染性幼虫的食物或粪便，且长期关在笼舍内，运动量较少，机体免疫力下降，导致毛首线虫卵在体内大量繁殖。

3.3 人兽共患风险分析

有研究报道，人类偶尔会被外阴锥虫（T.vulpis）和猪鞭虫感染，它们被认为是人兽共患的虫种［28-30］。近年来有学者将鞭虫作为自身免疫性疾病的一种治疗选择，如炎症性肠病［31-32］，这激发了人们对人类、非人灵长类和其他近缘物种的毛首线虫分类地位及其人兽共患潜力的调查研究［33］。传统意义上，灵长类动物的鞭虫被称为毛首线虫（或更保守的说是毛首线虫属），最近的分子证据表明，存在多个感染灵长类动物的毛首线虫虫种，但没有明确定义其物种边界及其传播给人类的可能性［33］。

本研究通过系统进化树（图3）可见，来自非人灵长类和啮齿类动物体内的毛首线虫分离株汇聚在两大分支，与Ravasi 等［30］提出的不同种毛首线虫对于宿主的主观偏好存在差异的结论趋向一致；成年人和南非阿拉伯狒狒的毛首线虫虫株聚合到一个大分支，佐证了Ravasi 等［30］曾指出的毛首线虫在南非的狒狒和人类之间存在潜在交叉感染，系统发育分析表明2 种宿主均被2 个不同的虫种感染。同时本研究结果支持李梅等［34］基于ITS 基因序列构建的进化树得出的人和非人灵长类动物感染的毛首线虫是近缘种这一结论。其他相关研究也说明，毛首线虫存在严重的人兽共患风险［16，35-37］，具有潜在的交叉感染可能。

3.4 防控建议

毛首线虫病是人与动物常见的寄生虫病，呈世界性分布，多分布于热带地区，是一种容易被忽视的热带寄生虫病［38］。对于本病的发生，多与园区的饲养管理不善有关；其次，温湿的环境有助于毛首线虫卵的发育，导致重复感染。做好预防措施能够有效地防止毛首线虫感染，一方面要注意笼养环境的保持，另一方面对于感染毛首线虫的滇金丝猴要及时进行隔离和驱虫处理，尽量避免与健康的滇金丝猴接触，并定期采集粪便检查以观察驱虫效果［21］。

毛首线虫作为一种人兽共患寄生虫，有潜在的交叉感染可能，存在人兽共患风险。滇金丝猴通过人工养殖或动物园观赏表演与其他动物或人产生的密切接触可能引发毛首线虫感染风险，诱发其他疾病，对人类健康及公共卫生安全有着严重的负面影响，故不能轻视。