幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病的防治

陈 欣，黄文俊，王小兰，李 碧，刘 礼，廖礼慧，文一帆，罗泽娟，吴 星，陈 敏，邓 陶，代 莎，罗 娌

（成都大熊猫繁育研究基地，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都，610081）

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）作为我国保护生物学旗舰物种，兽医学研究对其全生命周期健康管理起到至关重要的作用。皮肤癣菌病（dermatophytosis）作为一种大熊猫临床兽医学多发的感染性疾病，不仅会导致严重的皮损，还会影响大熊猫的生长发育，如处置不当易继发二重感染威胁生命安全。目前已分离到可引起大熊猫皮肤癣菌病的病原有白色念珠菌（Candida albicans）［1］、须毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）［2］、枝孢样枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）［3］和石膏 样小孢子菌（Microsporum gypseum）［4］等，但关于流行病学、临床特点和防治措施的报道较少。

近年来成都大熊猫繁育研究基地发生多例幼年大熊猫患皮肤癣菌病的案例，通过综合运用临床诊断方法确诊为石膏样小孢子菌感染，经药敏试验不断调整优化防治措施，最终取得满意效果。幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病是一种发病率高、病程长和传染性强的皮肤癣菌病，为提高对该病的诊断准确性，缩短治疗时间，提升治愈率，现将该病的流行病学、临床特点、临床诊断方法和防治措施总结如下，以供同行参考。

1 流行病学

石膏样小孢子菌性皮癣病主要发生于幼年大熊猫（9～15 月龄），此月龄大熊猫正处于母乳采食量逐步减少阶段。该病具有明显的季节性，集中发生在高温潮湿的夏秋两季，此时天气炎热导致大熊猫外放时间减少，皮肤因缺乏阳光照射，且兽舍内环境中真菌数量激增，导致真菌孢子、菌丝和分泌的多种酶类对大熊猫的皮肤角质层、被毛具有极强的侵袭力［5］。此外，该病具有群发性特点，临床上常见同一或临近兽舍的幼年大熊猫群体性发病。由于引发皮癣菌病的真菌本身具有极强的生存能力，通过患兽之间的直接或间接接触均易造成疾病传播。

2 临床特点

石膏样小孢子菌性皮癣病引发的典型皮肤病变为出现一块或多块圆形、直径为硬币大小并快速扩展的脱毛皮肤表面癣斑，又称“钱癣”（图1）。常见癣斑处出现大量脱毛与大量白色陶土样脱屑，局部炎症刺激会导致水肿、丘疹和龟裂等皮肤损伤，并伴有瘙痒。上述皮肤癣斑好发于患兽的四肢、臀部等经常接触地面容易被污染的身体部位。当患兽仅为局部性感染时，临床症状以皮肤病变为主，血液指标一般无明显异常，病程一般为14～28 d；当患兽继发全身性感染时，除皮肤病变外，还会出现采食量下降、精神沉郁和体温升高等临床症状，血液指标常见白细胞计数、中性粒细胞百分比以及血沉等炎性指标急剧上升，病程多迁延不愈。

图1 石膏样小孢子菌性皮癣病典型的皮肤病变Fig.1 Typical skin lesions of dermatophytosis caused by Microsporum gypseum

3 临床诊断

3.1 初步诊断

3.1.1 伍氏灯检查

在暗室内使用波长为320～400 nm 的伍氏灯直接照射患病大熊猫皮肤癣斑处的皮肤、皮屑和毛发，检查过程中均未观察到明显的荧光反应，但该检查仅能作为初步筛查手段，无法准确判断是否存在真菌感染。

3.1.2 直接镜检

用消毒后的手术刀片刮取患病大熊猫皮肤癣斑处的皮屑、毛发等病料，放置载玻片上，滴入10%KOH湿片检查。镜下观察可见少量的成串小孢子和菌丝，初步判断存在真菌感染，但无法确定菌种。

3.1.3 菌种分离培养与初步鉴定

采用钢圈法真菌小培养［6］。首先将钢圈固定于无菌载玻片上，再用无菌注射器经孔口注入融化的皮肤癣菌鉴定培养基（dermatophyte test medium，DTM）中，培养基约占钢圈容量的一半，然后用消毒盖玻片封闭钢圈表面，最后用接种针将采集的病料接种于环内培养基上。25 ℃培养3 d，观察发现有大量菌落生长（图2A）。用乳酸棉酚蓝染色后在镜下观察，可见呈纺锤形的大分生孢子，每个大分生孢子有4～6 个间隔，有少量结节状菌丝（图2B），初步判断为石膏样小孢子菌感染。

图2 石膏样小孢子菌的分离培养与鉴定Fig.2 Isolation，culture and identification of Microsporum gypseum

3.2 PCR测序鉴定

按照Ezup柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）说明书提取该菌株的DNA，使用真菌rDNA 内转录间隔区（ITS）序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行真菌ITS 扩增［7］，PCR 产物的后续序列测定由生工生物工程（成都）有限公司完成。将测序结果与GenBank中的核酸数据库进行BLAST 比对分析，相似性最高的前10 位菌株均为石膏样小孢子菌，覆盖率为97%，相似度为100%，故确诊该真菌为石膏样小孢子菌。

3.3 药敏试验

采用纸片扩散法［8］，将菌种均匀涂布于沙氏琼脂培养基（Sabourauds agar，SDA）中，待干燥后用无菌镊子在培养基正中间贴上药敏纸片，封口培养基并标记。培养基放置于真菌培养箱内28 ℃培养7 d，依据培养基上的抑菌圈直径来判定药物敏感程度。药敏试验显示该真菌对咪唑类药物、丙烯胺类药物和三唑类药物较敏感（表1）。

表1 石膏样小孢子菌药敏试验结果Tab.1 The drug susceptibility result of Microsporum gypseum

4 防治措施

根据石膏样小孢子菌感染的致病机理和幼年大熊猫的生物学特点，结合近年来对该病的临床治疗与跟踪观察，总结出综合防治措施，不仅能缩短疗程，使治愈率达到100%，并且极少发生并发症。具体措施：（1）抗真菌治疗。剃除病灶区毛发，清理皮屑、痂皮，患处及周围皮肤先使用2%洗必泰清洗（2 次/d，连用14 d 以上），待干燥后涂抹萘替芬酮康唑乳膏（2 次/d，连用14 d 以上）。（2）抗细菌继发感染。患处及周围皮肤错开抗真菌药物使用时间，涂抹环丙沙星乳膏（2 次/d，连用14 d 以上），当患兽出现全身性感染时，可另增加口服头孢泊肟酯片 ［5 mg/（kg·次-1），2 次/d，连用7 d］。（3）补充皮肤营养。口服复合维生素B（2 片/次，2 次/d，连用14 d 以上）。（4）隔离饲养并做好环境卫生消毒。隔离饲养发病大熊猫以防止交叉传染，保证兽舍的日常卫生和通风干燥，同时确保能受到一定时间的阳光照射，定期使用聚维酮碘（浓度为5%，1∶400 倍稀释）［9］、杜邦卫可（1∶100 倍稀释）和84 消毒液（有效氯质量浓度500 mg/L）对兽舍喷洒消毒，交叉使用火焰喷枪对兽舍地面、墙面和兽栏进行火焰消毒。

5 讨论

5.1 石膏样小孢子菌性皮癣病对幼年大熊猫的致病性

石膏样小孢子菌是亲动物性和亲土性皮肤癣菌，可引起人和多种动物感染，直接接触是该菌的主要传播途径［5］。该菌感染人和动物的临床表现多种多样，在人［10］上可引发脓癣、体癣和白癣等，在犬［11］、小熊猫（Ailurus fulgens）［12］等动物上常可见黄癣样皮损、脓性丘疹。对于大熊猫，临床上该菌主要感染幼年大熊猫，主要引发圆形钱癣伴大面积皮肤损害，并发脱毛、皮屑和水肿等，若处置不及时易继发细菌感染，严重个体甚至出现全身性炎症反应。该菌针对幼年大熊猫的致病性强可能与以下因素相关：（1）幼年大熊猫皮脂腺发育尚不完善，皮脂分泌量较少，无法有效抑制真菌繁殖。因为皮脂不仅具有参与形成表皮脂质膜，维持表皮屏障的功能，而且其中的脂肪酸还具有抑制真菌活性的作用［13］。（2）幼年大熊猫免疫器官，如胸腺、脾脏和淋巴结等发育均尚不完善，机体处于低免疫力状态时更易受皮肤癣菌感染，同时极低水平的免疫特性导致幼年大熊猫对母源抗体的依赖性极强［14］，这也是该病主要发生于幼年大熊猫母乳采食量逐步减少阶段的原因。（3）石膏样小孢子菌致病力较强，菌体除自身增殖、释放毒素和变应原外，还能产生外分泌性蛋白酶使菌体更易于侵入角质引起皮肤炎症的反应［10］。（4）高温潮湿的夏秋两季有利于真菌大量生长繁殖，此时幼年大熊猫群体性集中在室内兽舍饲养时间较长，一旦发病极易在群体间交叉传染。

5.2 石膏样小孢子菌性皮癣病临床诊断的作用

皮肤癣菌病临床表现多种多样，依据患兽的流行病学、临床症状仅能怀疑存在真菌感染，确诊需要进一步的临床诊断。临床诊断中伍氏灯检查方便快速，但荧光反应易受多种外界因素影响，故只能作为初步筛查手段。直接镜检和菌种鉴定培养是行之有效的传统手段，但菌种形态受多种因素影响且变化大，也仅可进行初步判断。分子生物学技术以特异性好、灵敏性高的优势逐步应用于大熊猫皮肤癣菌病的诊断中。马晓平等［3］、张悦天等［4］应用分子生物学技术分别确诊枝孢样枝孢霉和石膏样小孢子菌可导致大熊猫皮肤癣菌病。

为明确近年来反复引发成都大熊猫繁育研究基地幼年大熊猫皮肤癣菌病的病因，在总结该病的流行病学、临床特点的基础上，综合应用皮肤癣菌病临床诊断方法，确定了石膏样小孢子菌为其病原，并经药敏试验与临床实践筛选出局部外用萘替芬酮康唑等防治措施，最终取得满意效果，可见规范细致的临床诊断对皮肤癣菌病的科学用药和预防具有指导意义。

5.3 石膏样小孢子菌性皮癣病防治措施

石膏样小孢子菌性皮癣病属于浅部皮肤病原真菌引起的一类传染性极强的人兽共患病。结合幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病临床特点和药敏试验结果，选用萘替芬酮康唑作为抗真菌药局部外用。萘替芬作为丙烯胺类药物可选择性地抑制角鲨烯环氧化酶的活性，从而抑制麦角固醇的合成；酮康唑作为咪唑类药物可选择性干扰细胞色素P-450 的活性，从而抑制麦角固醇的合成。两者均可抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成从而抑制真菌细胞的生长，合用时有协同作用，可增强抗菌活性，降低耐药风险，提升局部皮肤的药物浓度［15］。当患兽仅为局部性感染时，局部外用抗真菌药物时长应持续14 d 以上，直至患处皮肤恢复，被毛生长且未有扩散迹象后再考虑停药。抗真菌药物的局部外用相比于口服药物，对幼年动物的胃肠道、肝肾功能的副作用更小。当患兽已出现全身性感染时，还应通过口服或注射途径给予抗生素类药物防止炎症进一步扩散，必要情况下，可考虑给予短期、小剂量的糖皮质激素以抗炎和免疫抑制［16］。

幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病主要发生于高温潮湿的夏秋两季，此时，作为亲土性真菌的石膏样小孢子菌不仅可以气溶胶的形式存在于兽舍环境内，也可沉降附着在兽舍的地面、墙面和兽栏的表面。因此，一方面兽舍消毒防控应保证定期轮替使用多种消毒液喷洒消毒，并交叉进行火焰消毒；另一方面，针对幼年大熊猫（9～15 月龄）的饲养管理应注重保持动物体表与环境卫生，适时外放动物保证一定时间的光照，加强动物体况检查尤其是皮毛触诊，一旦发现皮肤癣菌感染要立即采取隔离措施，这是切断种群间交叉传染的关键。