胶体金免疫层析法快速检测肉类中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄残留的应用验证研究

邓 波 朱卫芳 周雨璊 张维谊 宋宇迎 王 敏 朱春燕詹定生 詹 林 丰东升

（1.上海市农产品质量安全中心，农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708；2.上海市青浦区农产品质量安全中心，上海 201799；3.上海北锦实业有限公司，上海 200241）

畜禽和水产品养殖过程中，为了治疗或预防疾病，部分养殖场滥用抗生素，或长时间使用低剂量的抗生素，造成细菌产生耐药性，使抗生素治疗效果降低，影响养殖行业发展[1]。有学者分析了2018-2020年上海市畜禽肉及蛋类质量情况，发现畜禽肉及蛋类食用农产品质量基本稳定，但药物滥用现象依旧存在[2]。

恩诺沙星（喹诺酮类抗生素）主要用于水产动物和畜禽，其抗菌作用主要通过阻断细菌DNA的复制而产生。四环素（四环素类抗生素）可防治家禽多种疾病，除对常见的革兰氏阴性菌、寄生虫等有杀灭效果外，还具有减轻禽类应激反应、增加产蛋量和提高孵化率等效力，其作用机理主要对细菌蛋白质合成的肽链合成阶段及终止阶段起作用。头孢氨苄属于一代头孢类抗生素，是畜禽疫病防治中较常用的抗生素之一，对革兰氏阳性和阴性菌均有较好的抵抗力，通过影响细菌细胞壁的生物合成而起到杀菌作用。

目前，针对以上抗生素类兽药多残留的检测方法主要有高效液相色谱法[3～4]、气相色谱-串联质谱法[5～6]以及液相色谱-串联质谱法[7～9]。但这些方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作培训，且检测周期长，不适用于现场快速检测大批量样品。同时，目前检测以上兽药的快速检测试纸条（快速检测卡）多为新上市产品，各个厂家产品质量良莠不齐，还缺乏相应的产品性能应用验证。本研究对胶体金免疫层析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）快速检测肉类中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄残留的适用性、准确性等开展应用验证，以期能弥补以上不足。快速检测试纸条（快速检测卡）携带方便、操作简便，对检测人员要求较低，反应时间短，适合在市场监管和农产品执法过程中用于现场大批量样品快速检测和初筛，经应用验证后可广泛推广应用，具有现实研究意义[10]。

一、材料与方法

（一）材料与试剂在市场上购买不同批次的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、兔肉、鱼肉。恩诺沙星快速检测卡、四环素快速检测卡、头孢氨苄快速检测卡均购自上海北锦实业有限公司；恩诺沙星、四环素、头孢氨苄标准品均购自坛墨质检科技股份有限公司。

（二）仪器与设备药物残留检测仪（BJNYW3T，上海北锦实业有限公司）、液相色谱-串联质谱［LC-MS/MS 1200-6410，安捷伦科技（中国）有限公司］。

（三）胶体金免疫层析法

1.检测原理。由于小分子抗原很难制备得到配对抗体（相对分子质量小，很难找到两个结合位点供两个抗体同时结合），因此小分子抗原无法用双抗夹心法进行检测，通常利用竞争法进行检测。

使用竞争法的胶体金检测平台，在试剂条的结合垫上固定的是金标抗体或者将标记好抗体的胶体金封闭在微孔内，NC膜上T线包被的是大分子偶联的待测抗原（小分子抗原不能直接固定于NC膜上，需要通过化学方法把小分子偶联到牛血清白蛋白等大分子物质上再固定于NC膜上），C线上固定的是能与金标抗体特异性结合的二抗（见图1）。

图1 竞争法胶体金免疫层析试纸条检测原理

当待测样品液体滴加到试剂条上后，通过层析作用，液体依次会流经结合垫、T线、C线，当样品中有被检测物时，T线会受到抑制，不显色或者显色比C线淡。反之，T线显色比C线深或者一样深（见图2）。

图2 竞争法胶体金免疫层析试纸条检测结果

2.检测步骤。前处理：将待检的去脂肪组织样本绞碎，称取0.25 g待测样品于1.5 mL带刻度离心管中，加入0.75 mL专用稀释液，剧烈振荡5 min，室温下以4 000 r/min离心5 min，吸取上清溶液120μL（约4滴）待检。

检测：将用移液枪或滴管吸取的120μL（约4滴）待检样品溶液，垂直滴于金标微孔中，浸泡2 min后用移液枪或滴管将金标微孔中的金与待检液体充分混匀，并将待检液体全部加入快速检测卡的加样孔中，等待8～10 min读取结果。

（四）液相色谱-串联质谱法恩诺沙星、四环素的检测按照GB 31658.17-2021《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》规定的方法进行，检出限为2μg/kg，定量限为10 μg/kg。

头孢氨苄的检测按照GB 31658.4-2021《食品安全国家标准 动物性食品中头孢类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》规定的方法进行，检出限为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg。

（五）灵敏度试验根据GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》，恩诺沙星在肉中的残留限量值为0.1 mg/kg（产蛋期禁用），四环素在肉中的残留限量值为0.2 mg/kg；头孢氨苄在牛肉中的残留限量值为0.2 mg/kg，在禽肉和其他畜肉中未规定残留限量值。本研究根据恩诺沙星、四环素、头孢氨苄在各类肉中的限量标准，对每种肉类均设置4个加标浓度，即本底浓度（空白）、1/2限量值浓度（或胶体金快速检测卡标识的检出限浓度，即若胶体金快速检测卡标识的检出限浓度低于限量值浓度则设定为胶体金快速检测卡标识的检出限浓度）、限量值浓度（或胶体金快速检测卡标识的检出限浓度）、2倍限量值浓度（或2倍胶体金快速检测卡标识的检出限浓度）。除标准中明确限量的肉类品种外，另选几种市面上常见的肉类作为验证样品开展灵敏度试验。根据以上原则，经过前期试验摸索，确定了恩诺沙星加标浓度为0、0.05、0.10、0.20 mg/kg；四环素加标浓度为0、0.04、0.08、0.16 mg/kg；头孢氨苄加标浓度为0、0.01、0.02、0.04 mg/kg。每份试验样品均做3个重复，每种兽药各选定7种肉类作为灵敏度试验样品。

（六）实物阳性样品验证试验准确称取恩诺沙星、四环素和头孢氨苄标准品，用甲醇溶解，均配置成浓度为10μg/mL的标准溶液，再将标准溶液加入已确认为阴性的肉类样品中，先用液相色谱-串联质谱法对样品中兽药残留进行定量检测，再将样品稀释到胶体金快速检测卡检出限的0.5、1.0、2.0倍水平，每个水平做10个重复。

（七）交叉反应测试选择氟苯尼考 （酰胺类）、多西环素（四环素类）、地塞米松（糖皮质激素）、链霉素（氨基糖苷类）、氯霉素（氯霉素类）、红霉素（大环内酯类）、甲硝唑（硝基咪唑类）、庆大霉素（氨基糖苷类）共8种兽药开展交叉反应测试。将8种兽药标准品配制成为浓度均为20 μg/mL的混合标准储备液，再分别稀释成0.08、0.05、0.02 mg/kg的混合标准溶液，待用。用恩诺沙星、四环素、头孢氨苄快速检测卡分别测试不同浓度的混合标准溶液，观察是否有交叉反应。

（八）结果评价按照原国家食品药品监督管理总局制定的《食品快速检测方法评价技术规范》，评价胶体金免疫层析法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率以及与参比方法的差异性。

二、结果与分析

（一）灵敏度本研究开展了应用胶体金免疫层析法检测不同肉类基质中3种兽药的灵敏度试验，结果显示恩诺沙星的检出限均能达到0.05 mg/kg，四环素的检出限均能达到0.08 mg/kg，头孢氨苄的检出限均能达到0.02 mg/kg，均能满足日常监管要求（见表1～表3）。

表1 胶体金免疫层析法检测恩诺沙星的灵敏度试验结果 （n＝3）

表3 胶体金免疫层析法检测头孢氨苄的灵敏度试验结果 （n＝3）

（二）假阳性率随机在市场上抽取7种肉类各3份，用液相色谱-串联质谱法检测确认为阴性后，再用胶体金快速检测卡进行检测以验证其假阳性率。结果显示，胶体金免疫层析法检测恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的假阳性率均为0%（见表4）。

表4 胶体金免疫层析法检测恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的假阳性率 （n＝3）

（三）假阴性率准确称取恩诺沙星、四环素和头孢氨苄标准品，用甲醇溶解，均配置成浓度为10μg/mL的标准溶液，再将标准溶液加入已确认为阴性的肉类样品中，使其在肉类样品中的终浓度分别为0.05、0.08、0.02 mg/kg，然后用胶体金快速检测卡进行加标验证，结果见表5。由表5可以看出，胶体金免疫层析法检测恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的假阴性率均为0%。

表5 胶体金免疫层析法检测恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的假阴性率 （n＝3）

（四）实物阳性样品验证实物阳性样品验证试验结果见表6。如表6所示，实物阳性样品验证恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的假阳性率和假阴性率均为0%，与参比方法均无显著性差异（χ2＜3.84）。

表2 胶体金免疫层析法检测四环素的灵敏度试验结果 （n＝3）

表6 恩诺沙星、四环素和头孢氨苄的实物阳性样品的验证结果 （n＝10）

（五）交叉反应测试用100个恩诺沙星胶体金快速检测卡测试上文“（七）交叉反应测试”中配置的0.05 mg/kg混合标准溶液，结果均为阴性；用100个四环素胶体金快速检测卡测试上文“（七）交叉反应测试”中配置的0.08 mg/kg混合标准溶液，结果均为阴性；用100个头孢氨苄胶体金快速检测卡测试上文“（七）交叉反应测试”中配置的0.02 mg/kg混合标准溶液，结果均为阴性。

三、结论

本研究对胶体金免疫层析法快速检测肉类中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄残留的适用性、准确性等开展应用验证，结果表明，方法灵敏度较高，检测肉类基质中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄的检出限分别为0.05、0.08、0.02 mg/kg，基本能满足一般基质中恩诺沙星、四环素和头孢氨苄残留的检测要求。此外，方法的检测结果与液相色谱-串联质谱法的检测结果无显著性差异，且检测更快捷，15 min内即可完成1件样品从前处理到读取结果的全部检测工作。

本研究所用的胶体金免疫层析法操作简便，检测人员只需稍加培训即可进行检测操作，适合市场监管部门和基层农产品质量安全监管部门日常快速筛查使用。但该方法目前能检测的兽药品种不多，与实际生产的需求还有一定差距，市场上经权威机构验证的产品也很少，需要进一步提高该类产品在生产和基层一线的适用性验证，以满足当前我国肉类监管的实际需求，实现源头监管的理念。