3D 打印对多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2装载、释放及成骨细胞增殖、分化的影响

井文森，许珂，高青，许鹏，彭侃

1 西安交通大学附属红会医院关节病医院骨坏死与关节重建科，西安 710054；2 西安市人民医院（西安市第四医院）骨科

钛合金广泛用于组织再生，具有生物相容性高、机械强度高、耐腐蚀和细胞附着等优点［1］。然而，未经任何修饰的原始钛移植物几乎是惰性的，因此无法在体内实现骨整合［2］。为了获得具有增强成骨能力的生物活性骨-植入物界面，已实验了各种方法来改变钛合金表面的骨整合，如骨形态形成蛋白2（BMP-2）作为生物性材料复合至人工关节假体表面涂层中用以制备复合涂层，改善和促进钛表面的骨整合［3］。BMP-2 作为转化生长因子-β 超家族成员，是一种有效的形态发生素，在人类发育中起关键作用，广泛参与骨形成和再生［4］。多数研究显示，BMP-2 可涂覆到支架上，以构建用于骨缺损愈合的输送系统，然而，这种方法存在部分缺点，如剂量不准确、流量不受控制和BMP-2 在涂层表面的装载率低，可能导致切口并发症、骨吸收等问题［5］。3D 打印技术的出现使外科医生能制造出与骨缺损相匹配的任意形状、可控的孔形状和孔隙率、良好的孔连通性以及临床适用性的钛合金假体，且3D打印金属植入物已用于临床实践并取得良好预后［6-8］。但3D 打印对多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件的BMP-2 装载率、累计释放率的影响尚不清楚。因此，本研究主要探究3D 打印对多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2 装载率、累计释放率的影响及3D 打印多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件对成骨细胞增殖、分化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 钛合金Ti6Al4V 金属粉末购自成都华寅粉体科技有限公司；小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 购自齐一生物科技（上海）有限公司；BMP-2 ELISA 试剂盒购自上海名劲生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自上海继和生物科技有限公司；兔源一抗Runt 相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、GAPDH及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.2 多孔钛合金试件表面BMP-2 生物复合涂层的制备及分组 ①多孔钛合金试件的设计：3D 打印多孔钛合金试件设计：使用3D设计软件进行参数化建模，孔隙率设定为70%，直径6 mm、高6 mm 的圆柱形钛合金多孔试件。高温烧结多孔钛合金试件设计：直径6 mm、高6 mm 的圆柱形钛合金多孔试件。②多孔钛合金试件的制备：3D 打印多孔钛合金试件制备：按照研究设计，将建立的三维模型导入3D 金属打印机中，铺粉装置先将钛合金粉末平推到成型缸基板上，之后固定扫描间距，启动打印，制备3D打印多孔钛合金试件。高温烧结多孔钛合金试件制备：将钛合金材料，用等离子旋转电极法制备成球形钛珠粒，用24目和32目筛子筛选出直径为500～700 μm的钛珠粒，将其填装入内腔为直径6 mm、高6 mm 的圆柱体的模具中，真空烧结炉内，抽真空，至10～30 Pa时，开始加热，在200 ℃时保温15 min，以使件内的水分充分蒸出，继续加热，400、600、800、1 000、1 200 ℃，分别保温15 min，至1 300 ℃时保温2 h，停止加热，随炉冷却，这时钛珠粒之间已牢固烧结。去除模具，高温烧结多孔钛合金试件即完成制备。③多孔钛合金试件表面羟基磷灰石（HA）涂层的制备：取上述两组多孔钛合金试件，采用微弧氧化技术在试件表面制备HA 涂层，作BMP-2 的复合载体之用。④多孔钛合金试件表面BMP-2 生物复合涂层的制备：上述两组多孔钛合金试件表面通过化学沉积法在其表面复合BMP-2 生物活性成分，分别制备3D 打印多孔BMP 复合涂层试件、高温烧结多孔BMP 复合涂层试件。将制备成功的3D 打印多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件作为实验组，另取制备成功的高温烧结多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件作为对照组。

1.3 多孔BMP-2复合涂层试件的表征观察分析 扫描电镜观察多孔BMP 复合涂层试件微孔的大小、形状、孔径、孔隙率、孔深度等表征。

1.4 多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件表面多孔涂层中BMP-2的装载率测定 采用125I放射性标记法。参照文献［5］方法，通过125I 放射性标记法测定多孔BMP-2复合涂层钛合金试件表面多孔涂层中BMP-2的装载率。

1.5 多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2 累计释放率的测定 将3D 打印多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件、高温烧结多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件分别置于含有40 mL PBS 缓冲液的试管中，恒温37 ℃，放置21 d。通过ELISA 试剂盒测定该缓冲液中每天BMP-2 的含量，计算不同时间BMP-2 的累计释放率。

1.6 细胞培养 在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养MC3T3-E1 细胞，培养条件为37 ℃、5%CO2。每隔1 d更换1次培养基。

1.7 MC3T3-E1 细胞在多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件上的生长情况观察 细胞接种前分别将3D打印多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件、高温烧结多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件置于24孔板中，再将1 mL 含有 2×104个MC3T3-E1 细胞的细胞悬液接种到每个试件的表面，并孵育1、7 d。在每个时间点，将试件转移到新的24 孔板中，用PBS 洗涤，2.5%戊二醛固定4 h。用一系列分级乙醇对试件进行脱水、干燥，通过扫描电镜检查试件上的细胞形态。

1.8 细胞增殖能力检测 采用CCK-8 法。将试件添加到24孔板中，并将MC3T3-E1细胞以2×104个的密度接种到每个试件上孵育 1、3、5 d。在预定时间点，将试件转移到新的24 孔板中并用PBS 洗涤。将试件上的细胞与300 μL DMEM 和30 μL CCK-8 溶液在培养箱中共孵育1 h，然后使用酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD）。

1.9 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 表达检测 采用qRT-PCR 法。将试件添加到24 孔板中，再将3.5×104个细胞接种到每个试件上利用DMEM 培养基2 d，分化诱导培养基培养12 d，然后终止培养，用TRIzol 试剂裂解每个试件上的细胞，并通过离心收集提取的总RNA，将总RNA 反转录为cDNA 后，以cDNA 为模板在Bio-Rad iQTM5 系统上进行荧光定量 反 应。以GAPDH 为 内 参，采 用2-ΔΔCt法 计 算RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 表达。RUNX2 正向引物：5” -CTTCTTCTTCAATACCAAGTT-3” ，反向引物：5” -AGCATCTCCTTCATACATC-3” ；ALP 正 向 引物：5” -TGCCTACTTGTGTGGCGTGAA-3” ，反向引物：5” -TCACCCGAGTGGTAGTCACAATG-3” ；OCN 正 向引物：5” -GACGAGTTGGCTGACCACA-3” ，反向引物：5” -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3” ；OPN 正 向 引物：5” -GCTCAGCACCTGAATGTACC-3” ，反向引物：5” -CCTCGGCTCGATGGCTAGC-3” ；GAPDH 正 向 引物：5” -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3” ，反向引物：5” -TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3” 。

1.10 RUNX2、ALP、OCN、OPN 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。按照1.9中的方式将MC3T3-E1 细胞于分化诱导培养基培养12 d 后，用RIPA 裂解缓冲液裂解并提取每个试件上的细胞的总蛋白，蛋白质经定量、电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗RUNX2（1∶2 000）、ALP（1∶1 000）、OCN（1∶2 000）、OPN（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下过夜孵育，然后将膜与二抗在室温下共同孵育1 h。加入ECL 试剂观察蛋白质条带，Image J 软件用于评估各个蛋白的灰度值。

1.11 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量数据符合正态分布以±s表示，组间比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件表征观察比较 与对照组比较，实验组的孔形状规则，分布更均匀，见图1。实验组与对照组孔径分别为（430.37 ± 7.75）、（268.67 ± 24.45）μm，孔深度分别为（537.75 ± 6.55）、（84.48 ± 7.25）μm，与对照组比较，实验组孔径、孔深度升高（P均＜0.05）。由于对照组孔随机分布，且存在部分孔重叠现象，故未测量孔隙率，而实验组的孔隙率为（68.24 ± 2.31）%。

图1 扫描电镜观察两组多孔BMP-2复合涂层钛合金试件表面形貌

2.2 两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2装载率比较 实验组与对照组BMP-2 装载率分别为（41.46 ± 3.27）%、（16.67 ± 1.58）%，与对照组比较，实验组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2装载率升高（P＜0.05）。

2.3 两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2累计释放率比较 与对照组比较，实验组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2 累计释放率（1、3、6、9、12、15、18、21d）升高（P均＜0.05），见表1。

表1 两组多孔BMP-2复合涂层钛合金试件BMP-2累计释放率比较（%± s）

表1 两组多孔BMP-2复合涂层钛合金试件BMP-2累计释放率比较（%± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

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2.4 MC3T3-E1 细胞在两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件上的生长情况 扫描电镜结果显示，培养1 d 后MC3T3-E1 细胞黏附在两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件表面，在孔内及孔壁处有大量细胞聚集。培养7 d 后，MC3T3-E1 细胞在两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件表面上紧密排列，在对照组试件表面，观察到排列紧密的细胞层可覆盖部分孔径较小的孔，而实验组试件表面可见致密的细胞层汇聚在孔径较大的孔中，见图2。

图2 扫描电镜观察培养1、7 d时MC3T3-E1细胞在两组多孔BMP-2复合涂层钛合金试件上的生长情况

2.5 MC3T3-E1 细胞在两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件上的增殖能力比较 与对照组比较，实验组MC3T3-E1 细胞在第3、5 天时的增殖能力升高（P均＜0.05）；两组MC3T3-E1 细胞在第1 天时增殖能力变化差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组MC3T3-E1细胞在第1、3、5天时的增殖能力比较（± s）

表2 各组MC3T3-E1细胞在第1、3、5天时的增殖能力比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组实验组OD450值第1天0.36 ± 0.02 0.38 ± 0.03*第3天0.47 ± 0.03 0.86 ± 0.07*第5天0.65 ± 0.05 1.37 ± 0.11*

2.6 MC3T3-E1 细胞在两组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件上的分化能力比较 细胞分化培养第14 d 时，与 对 照 组 比 较，实 验 组RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 及蛋白表达升高（P均＜0.05），见表3、4。

表3 细胞分化培养第14天时各组 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA表达比较（ ± s）

表3 细胞分化培养第14天时各组 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA表达比较（ ± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组实验组RUNX2 mRNA 1.00 ± 0.00 1.57 ± 0.11*ALP mRNA 1.00 ± 0.00 1.73 ± 0.12*OCN mRNA 1.00 ± 0.00 1.98 ± 0.14*OPN mRNA 1.00 ± 0.00 2.34 ± 0.15*

表4 细胞分化培养第14天时各组 RUNX2、ALP、OCN、OPN蛋白表达比较± s）

表4 细胞分化培养第14天时各组 RUNX2、ALP、OCN、OPN蛋白表达比较± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

3 讨论

钛合金是应用最广泛的人造骨替代品之一，因为它具有生物相容性和适宜的力学性能。然而，由于其生物惰性，导致这些“无生命”的材料只能作为支撑骨缺损的固定材料，而不能在假体与宿主骨之间形成良好的骨结合［9］。既往研究表明，将具有骨诱导活性的材料，如BMP-2 复合至金属植入物表面可促进植入物表面的骨长入，从而提高其在体内的稳固程度，被认为是提高假体-骨组织间骨整合最有效的方法［10］。但BMP-2 作为复合涂层中具有骨诱导活性的因子，其在涂层表面的装载率是影响其成骨活性的关键因素，更大的接触面积及多孔的涂层结构，理论上会较大程度地提高BMP-2 在涂层表面的装载率［11］。目前临床广泛使用的生物型人工假体，主要是通过高温烧结、高温喷涂等二次成型技术，在金属基体表面制备具有不同孔隙骨的涂层，如金属珠粒微孔涂层、金属丝纤维网状涂层、磨砂粗糙面涂层等，其制备过程复杂，且对表面金属涂层的孔径、孔隙率等结构无法精准掌控［12］。3D 打印技术是一种很有前途的方法，可以生成具有复杂组件和多孔部分的个性化植入物［13］，具有可控孔径和孔隙率的互连多孔植入物，可以显著降低刚度，更好地模仿天然骨组织的结构，促进骨再生和骨整合［14］。骨整合能力不仅取决于材料本身的骨传导性，还与植入物的孔隙分布、孔隙率和孔径大小有关。理想的骨科多孔植入物，其孔隙率应高于50%，特别是在65%～75%范围，孔径应在300～700 μm，这个范围有利于成骨细胞的黏附、增殖和分化［15］。本研究利用3D 打印多孔BMP-2复合涂层钛合金试件，结果显示实验组试件孔径为（430.37 ± 7.75）μm，孔隙率为（68.24 ± 2.31）%。本研究3D 打印多孔BMP-2复合涂层钛合金试件的孔隙率和孔径被认为具有理想的骨诱导参数。此外，本研究还发现，与对照组比较，实验组多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件BMP-2 装载率、BMP-2 累计释放率（1、3、6、9、12、15、18、21 d）升高，提示BMP-2在3D打印多孔BMP-2复合涂层钛合金试件中发挥作用效果优于高温烧结多孔BMP复合涂层试件。

本研究结果显示，培养7 d 后，对照组试件表面观察到排列紧密的细胞层可覆盖部分孔径较小的孔，而实验组试件表面可见致密的细胞层汇聚在孔径较大的孔中，与对照组比较，实验组MC3T3-E1 细胞在3、5 d 时的增殖能力升高，表明3D 打印多孔BMP-2 复合涂层钛合金试件可促进MC3T3-E1 细胞的生长与增殖。RUNX2、ALP、OCN、OPN 基因是衡量成骨不同阶段的重要指标［16］，本研究利用这4 个基因来反映MC3T3-E1 细胞分化情况，结果显示，细胞分化培养第14 天时，与对照组比较，实验组 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 及蛋白表达升高，差异有统计学意义，表明3D打印多孔BMP-2复合涂层钛合金试件促进了成骨细胞的分化。

综上所述，3D 打印对多孔BMP-2复合涂层钛合金试件BMP-2 装载率、BMP-2 累计释放率优于高温烧结多孔BMP 复合涂层试件。3D 打印多孔BMP-2复合涂层钛合金试件促进了成骨细胞的增殖与分化。