宫颈癌组织中Pax1、LMX1A 表达及其与临床病理特征和预后的关系

刘皓，杨雯，谭学贤，孙斌，熊汉真

1 广州医科大学附属第三医院病理科，广州 510145；2 广州医科大学附属第三医院妇科

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，在女性中的病死率仅次于乳腺癌［1］。宫颈癌的临床治疗包括手术、放化疗等，但疾病早期症状不典型，明确诊断时多已处于中晚期，错失最佳的手术治疗时机，患者远期生存预后较差［2-3］。配对盒基因1（Pax1）属于配对盒转录因子家族成员，包含一个配对盒结构域和一个配对型同源结构域，在胎儿发育过程中起关键作用［4］。研究表明，Pax1作为一种抑癌基因，在食管癌、口腔癌等恶性肿瘤中表达降低，其表达下调能够促进肿瘤侵袭和转移［5-6］。LIM 同源框转录因子1A（LMX1A）属于同源框转录因子家族，能结合到富含GC 碱基的基因启动子区调节基因转录［7］。在胃癌和肺癌等肿瘤中低表达，能抑制肿瘤细胞迁移［8-9］。本研究通过检测宫颈癌组织中Pax1、LMX1A表达，分析二者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016 年1 月—2017 年6 月广州医科大学附属第三医院诊治的103 例宫颈癌患者。年龄22～76（60.19 ± 8.71）岁；TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期73 例，Ⅲ期30 例；肿瘤直径：＜5 cm 62 例，≥5 cm 41 例；浸润深度：T1～T266 例，T3～T437 例；分化程度：低分化40例，中分化35例，高分化28例；病理类型：鳞癌80 例，腺癌15 例，其他类型8 例；肌层浸润45 例；淋巴结转移27 例。纳入标准：①患者均行宫颈癌根治手术治疗，经病理学诊断确诊为宫颈癌；②临床病理资料完整；③首次诊治。排除标准：①重度肝肾功能障碍；②合并其他肿瘤者；③近1个月内有全身性感染性疾病。本研究经过医院伦理委员会审核通过（20170614）。患者均签署知情同意书。

1.2 宫颈癌及相应癌旁组织中Pax1、LMX1A 表达检测 采用免疫组化染色法。宫颈癌及癌旁组织样本常规中性甲醛固定，梯度脱水后，组织包埋机进行包埋（深圳永年科技公司，型号：YN-02B1）。常规进行免疫组化染色。Pax1 和Anti-LMX1A 抗体购自美国Acam 公司（货号ab252847、ab82833）。DAB 显色后脱水、透明和固定，镜下（美国科特尔公司，型号：BP1500）观察染色结果。结果判定：阳性细胞数评分：阳性细胞比例≤5%为0 分，5%＜阳性比例＜25%为1 分，25%≤阳性比例＜50%为2 分，50%≤阳性比例＜75%为3 分，阳性比例≥75%为4分。染色强度评分：无色（0 分），淡黄色（1 分），棕黄色（2 分）和棕褐色（3 分），阳性细胞数评分和染色强度评分乘积为最终评分，0～4 为阴性，5～12为阳性［10］。

1.3 随访 患者出院后均定期进行电话和门诊方式随访，第1～2 年每3 个月随访1 次，以后每6 个月随访1 次。随访截至2022 年6 月，随访终点为患者死亡或随访时间结束。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，组间比较采用t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 法（Log-rank 检验）。单因素及多因素Cox 比例风险回归模型分析影响患者预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌及癌旁组织中Pax1、LMX1A 表达比较 免疫组化结果显示，Pax1、LMX1A 定位于细胞质和细胞核，棕色染色。103 例宫颈癌组织中Pax1表达阳性41 例（39.81%），癌旁组织中Pax1 表达阳性69 例（66.99%），差异有统计学意义（χ2=15.294，P＜0.05）（图1A、B）。103 例宫颈癌组织中LMX1A表达阳性40 例（38.83%），癌旁组织中LMX1A 表达阳性71 例（68.93%），差异有统计学意义（χ2=18.773，P＜0.05）（图1C、D）。

2.2 宫颈癌组织中Pax1 和LMX1A 蛋白表达与患者临床病理特征的关系 宫颈癌组织中不同TNM 分期和淋巴结转移患者中Pax1 和LMX1A 蛋白表达阳性率差异有统计学意义（P均＜0.05），不同患者年龄、肿瘤直径、浸润深度、肌层浸润、病理类型和肿瘤分化之间差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 Pax1和LMX1A蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

2.3 宫颈癌组织中Pax1 和LMX1A 蛋白表达与患者预后的关系 患者随访过程中，死亡46例，失访2例。Pax1 表达阳性、阴性宫颈癌患者的5 年生存率分别为75.6%（31/41）、38.71%（24/62），差异有统计学意义（χ2=4.386，P＜0.05）。LMX1A 表达阳性、阴性宫颈癌患者的5 年生存率分别为65.0%（26/40）、46.03%（29/63），差 异 有 统 计 学 意 义（χ2=3.487，P＜0.05）。

2.4 宫颈癌患者预后的Cox比例风险回归分析 以患者是否死亡作为因变量（0=存活，1=死亡），单因素及多因素Cox比例风险分析结果显示，TNM 分期、淋巴结转移、Pax1和LMX1A蛋白表达是影响宫颈癌患者预后的因素（P均＜0.05）。见表2、3。

表2 影响宫颈癌患者预后的单因素Cox比例风险回归分析

表3 影响宫颈癌患者预后的多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中排第2 位，仅次于乳腺癌。我国宫颈癌发病率较高，约为12.24/10 万，且以每年上升0.4%～1.5%的速度升高，病死率达2.64/10万［11］。宫颈癌治疗包括手术、放化疗等，但由于肿瘤恶性程度高，术后易出现局部复发及远处转移，患者生存预后较差［12］。因此，深入研究影响宫颈癌进展的分子机制，寻找宫颈癌诊断、治疗及预后密切相关的生物标记物有重要临床价值。

Pax1 编码基因位于20p11.22，该基因编码Pax1蛋白属于转录因子配对盒（PAX）家族的成员，其参与正常的胚胎发育、椎骨发育等生理学过程。近年研究发现，Pax1 在口腔癌、宫颈癌等肿瘤中表达下调，机制尚不明确，肿瘤中Pax1 发挥抑癌基因作用，其能通过抑制癌基因如c-myc 的表达，抑制肿瘤发生、发展［5-6］。本研究发现，宫颈癌组织中Pax1 蛋白表达明显下调，分析其原因可能是在宫颈癌中Pax1基因处于高甲基化状态，Pax1 的启动子区以及外显子区域高甲基化会导致RNA 聚合酶无法结合到Pax1 基因上而导致Pax1 基因转录异常，最终导致Pax1 基因表达下调［13］。本研究发现，Pax1 表达与TNM 分期、淋巴结转移相关，原因是Pax1 表达下调参与促进上皮—间质转化。DENG 等［14］研究发现，宫颈癌细胞的上皮—间质转化是宫颈癌细胞发生转移的主要机制之一。Pax1 表达下调可能促进上皮—间质转化过程，肿瘤细胞表面的纤维蛋白、胶原蛋白和钙黏蛋白等细胞黏附蛋白大量降解，使得肿瘤细胞黏附功能下降而发生转移［15-16］。同时，FARHAN等［17］研究发现，Pax1与人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）协同表达。由于PTEN 是磷脂酰肌醇3-激酶信号通路的抑制蛋白，并且基质金属蛋白酶-1 和基质金属蛋白酶-9 等均是磷脂酰肌醇3-激酶信号通路的下游靶基因［18］。因此，在宫颈癌中Pax1 表达下调可引起PTEN 表达下调，使得磷脂酰肌醇3-激酶信号通路异常激活，导致基质金属蛋白酶-1 和基质金属蛋白酶-9 表达异常，基质金属蛋白酶通过降解肿瘤细胞外基质促进宫颈癌细胞发生上皮—间质转化，促进肿瘤转移。

LMX1A基因位于1q23.3，该基因编码含有同源结构域和LIM 结构域的蛋白质，其编码的蛋白质是一种转录因子，功能上可作为胰岛素基因转录的正向调节因子［19］。近年研究表明，在胃癌、结直肠癌等肿瘤中LMX1A表达下调，导致下游β-连环蛋白表达降低，促进肿瘤细胞的无限增殖和侵袭［20］。本研究发现，在宫颈癌组织中LMX1A 蛋白表达明显下调，分析其原因可能是在宫颈癌中LMX1A 基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化修饰会抑制转录复合体的组装，导致转录起始复合体无法在LMX1A基因启动子区形成，LMX1A 基因转录受到抑制而导致其表达下降。同时，本研究发现，LMX1A 表达与TNM 分期、淋巴结转移相关。其机制可能是LMX1A作为抑癌基因，能够抑制肿瘤血管新生及肿瘤转移。QIAN等［21］研究发现，LMX1A 能抑制血管生成素样蛋白4的表达。因此，宫颈癌患者LMX1A表达下调会导致其对血管生成素样蛋白4 的表达抑制作用解除，血管生成素样蛋白4 表达上调，进而促进肿瘤血管新生，抑制肿瘤细胞凋亡并抑制氧化应激对肿瘤细胞造成的损伤，宫颈癌细胞通过肿瘤血管发生转移。同时抗凋亡以及抗氧化应激作用能够提高肿瘤细胞在转移过程中的存活率，导致宫颈癌患者病情恶化。

本研究中，103 例患者随访过程中死亡46 例，5年生存率为55.34%（57/103），低于既往文献报道[22]。分析原因，一方面是本研究纳入的患者年龄较大（平均年龄大于60 岁），且FIGO 分期较高，该部分患者临床治疗难度较大，预后较差，患者的病死率较高；另一方面，本研究样本量较小，结果可能存在一定的误差偏倚。本研究进一步分析宫颈癌组织中Pax1和LMX1A 蛋白表达与患者预后的关系，结果发现Pax1 及LMX1A 表达阳性的宫颈癌患者5 年生存率较高，表明Pax1 和LMX1A 蛋白表达检测有助于判断宫颈癌患者的生存预后。多因素Cox 回归分析结果显示，高TNM 分期、低Pax1和低LMX1A蛋白表达是宫颈癌患者预后的危险因素，提示宫颈癌组织中Pax1 和LMX1A 表达有可能成为新的判断宫颈癌患者预后的肿瘤标志物，但两者的具体作用机制有待深入研究。

综上所述，宫颈癌组织中Pax1 和LMX1A 表达下调，并与宫颈癌患者的TNM 分期、淋巴结转移相关，检测二者表达有助于宫颈癌患者的预后预测。