超声提取-高效液相色谱法测定生活用纸中11种荧光增白剂*

潘春燕，周雯迪，陆 阳，姚誉阳，朱鹏飞

（1.无锡市疾病预防控制中心 江苏省食品安全风险监测重点实验室(有机污染物领域)，江苏 无锡 214023；2.江苏省血吸虫病防治研究所 国家卫生健康委员会寄生虫预防与控制技术重点实验室江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室，江苏 无锡 214064）

荧光增白剂（fluorescent whitening agents,FWAs）是一种白色荧光染料，因其能吸收波长为300～400nm的紫外光，再激发出波长为420～480nm的蓝色或蓝紫色荧光，在视觉上达到增白或增亮的效果，因此，被广泛用于造纸行业[1]。其中，双三嗪氨基二苯乙烯类荧光增白剂是我国应用最多的一类荧光增白剂[2]。大量医学研究表明，荧光增白剂被人体吸收后，很难被分解或排出体外，会加重肝脏负担，并且会和伤口处蛋白质结合，阻碍伤口愈合。长期接触荧光增白剂，会对细胞的正常发育和生长产生影响，成为潜在的致癌因素[3,4]。

目前，荧光增白剂的测定方法主要有荧光分光光度法[5-7]、高效液相色谱法[1-4]和高效液相色谱-串联质谱法[8,9]。其中，荧光分光光度法只能实现荧光增白剂总量的测定，高效液相色谱-串联质谱法仪器昂贵，不易普及。而高效液相色谱法因分离效果好，检测成本低，与荧光检测器联用，灵敏度高，因此，被广泛应用于荧光增白剂的检测。生活用纸中荧光增白剂的检测报道较少，且被测物种类有限[5-7,10]，鉴于此，本文系统化地研究了多种生活用纸中常见的11种双三嗪氨基二苯乙烯荧光增白剂同时测定的方法，以期为相关的监管工作提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪，配荧光检测器（FLD）（美国安捷伦公司）；KS-600D型超声仪(宁波海曙科生超声设备有限公司)；KDC-16H型高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

11种荧光增白剂标准物质：FWA 5bm（CAS：4193-55-9）、C.I 85（CAS：12224-06-5）、C.I 113（CAS：12768-92-2）、C.I 71（CAS：43056-63-9）、C.I 90（CAS：3426-43-5）、C.I 24（CAS：12224-02-1）、C.I 210（CAS：28950-61-0）、C.I 220（CAS：12768-91-1）、C.I 264（CAS：76482-78-5）、C.I 357（CAS：41098-56-0）、C.I 353（CAS：55585-28-9），浓度均为100μg·mL-1，福州绿川生物科技有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国默克公司；HCl、三乙胺、四丁基溴化铵（TBA），均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为自制超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 将纸样品剪成5mm×5mm以下碎片，混合均匀，称取0.5g（精确至0.001g）置于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入25mL 40%乙腈水溶液（用三乙胺调节pH值为11.5），超声提取10min，以10000r·min-1速率离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中。再分两次向纸屑中加入12.5mL 40%乙腈水溶液，按上述方法重复提取两次。合并3次提取液，用HCl∶H2O=1∶1（V/V）溶液将提取液调至中性。加入40%乙腈水溶液定容至50mL，混匀，再以10000r·min-1速率离心5min，吸取上清液置于棕色进样小瓶中待测。实验在避光条件下进行（照度小于20Lux）。

1.2.2 标准溶液的配制

混合标准中间储备溶液的配制 分别吸取11种荧光增白剂标准溶液（浓度均为100μg·mL-1）各100μL，置于10mL棕色容量瓶中，用40%乙腈水溶液稀释至刻度，制得1μg·mL-1的混合标准中间储备溶液。

混合标准工作溶液的配制 分别吸取125、750、1375、2000、2500μL混合标准中间储备溶液于5mL棕色容量瓶中，用40%乙腈水溶液稀释至刻度，制得25、150、275、400、500ng·mL-1的混合标准工作溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250mm×4.6μm，5μm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温：35℃；进样体积：10μL；流速：1.0mL·min-1；流动相A：乙腈-甲醇（2∶3，V/V），流动相B：含25mmol·L-1TBA的甲醇-水（5∶95，V/V）（用三乙胺调节pH值为8.0）。梯度洗脱程序见表1。检测器为荧光检测器，激发波长350nm，发射波长430nm。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

2.1.1 提取溶剂 11种荧光增白剂均为阴离子型荧光增白剂，且含有多个非水溶性的苯环结构，故选择有机溶剂与水混合作为提取溶剂。试验了不同浓度的乙腈水溶液对回收率的影响，发现随着乙腈含量的提高，荧光增白剂的回收率呈上升趋势，当乙腈体积分数为40%时，8种荧光增白剂的回收率达到最大，但是，C.I 264、C.I 357和C.I 353的回收率始终极低，分别为7.3%、5.2%和3.1%，推测是溶液pH值对荧光增白剂分子结构有影响。该类荧光增白剂含有氨基，在碱性条件下更易被溶剂提取，故采用三乙胺调节提取液pH值，考察pH值为8.0～12.5对回收率的影响，结果见图1。

由图1可见，当pH值为11.5时，11种荧光增白剂的回收率达到最大。故方法采用40%乙腈水溶液（用三乙胺调节pH值为11.5）作为提取溶剂。同时考虑到后续的色谱分离，提取完成后用HCl∶H2O=1∶1（V/V）溶液调节pH值至中性。

图1 pH值对回收率的影响Fig.1 Effect of pH on the recovery

2.1.2 提取液体积和提取次数 试验了多种提取方案，回收率如下：25mL一次（82.3%～87.5%）；25mL两次（92.2%～97.6%）；25mL+12.5mL+12.5mL（95.2%～101.6%）；50mL一次（86.3%～94.8%）。结果表明，分3次提取，各物质的回收率最大，均达到95%以上。推测是由于纸制品易吸收液体，造成提取液转移不完全，故分次提取效果更好。同时考虑到提取液体积过大会降低灵敏度，增加有机溶剂的消耗量，故提取液总体积为50mL，采用25mL+12.5mL+12.5mL分3次提取。

2.1.3 提取时间和温度 试验了提取时间为5～20min，发现当提取时间超过10min以后，提取效率基本无变化，为节约时间，提取时间选择10min。

试验了水浴超声温度为室温、30、40、50、60℃，发现提取效率几乎不随温度发生变化，为节约能源，简化实验，水浴温度采用室温。

2.1.4 过滤膜 将400ng·mL-1的荧光增白剂标准溶液通过几种常见的微孔滤膜后上机测定，回收率结果如下：尼龙滤膜（0%～75.3%）、聚醚砜滤膜（60.3%～98.4%）、PTFE滤膜（18.5%～71.3%）和PVDF滤膜（41.3%～65.6%）。结果表明，采用任意一款滤膜，均有物质损失较大。考虑到提取液澄清透明，采用以10000r·min-1速率离心后未观察到明显的悬浮颗粒，同时色谱柱在进样过程中未发现压力增大，故提取液选择不通过过滤膜直接上机。

2.2 色谱条件的选择

色谱柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱，规格250mm×4.6μm,5μm；柱温35℃；进样体积10μL；流速1.0mL·min-1；检测器为荧光检测器，激发波长350nm，发射波长430nm。调节流动相使11种物质完全分离成为本实验的关键。

高效液相色谱最常用的流动相为甲醇、乙腈和水。尝试使用甲醇-水、乙腈-水体系，11种荧光增白剂均无法达到基线分离，且采用乙腈-水体系时，色谱峰拖尾严重。采用甲醇-乙腈-水体系分离，拖尾现象有所改善，当A相采用乙腈-甲醇（2∶3，V/V）时，B相采用甲醇-水（5∶95，V/V）时，峰型对称性较好，但11种物质色仍无法完全分离，可能是由于11种荧光增白剂均含有多个磺酸基团，致使极性较强，在C18柱中保留较弱。尝试在B相中加入正离子对试剂四丁基溴化铵（TBA）与磺酸基团结合以减小极性。同时，磺酸基团需在碱性条件下才能充分离子化，确保与离子对试剂相结合，故同时加入三乙胺调节pH值。考察了TBA的浓度为5～30mmol·L-1，pH值为7.5～10.0时对分离的影响，发现随着pH值的增大，分离度逐渐增大，当pH值为8.0时，分离度最好，当pH值大于9.0时，色谱峰出现明显拖尾，故选择最佳pH值为8.0。调节TBA的加入量，发现当TBA浓度为10mmol·L-1时，除C.I 264和C.I 353未能完全分离外，其他物质均分离较好；当TBA浓度为25mmol·L-1时，11种物质均实现完全分离；继续增加TBA浓度，分离情况无明显改善，考虑到TBA为固体物质，含量过高会造成色谱柱压力增大，甚至析出，造成色谱柱损坏，故浓度采用25mmol·L-1，并用三乙胺调节pH值为8.0。为兼顾分离度和分离时间，流动相采用梯度洗脱方式，最终优化得到表1中梯度洗脱程序。

图2a、b分别为标准物质和加标样品的色谱图。

图2 标准物质和加标样品色谱图Fig.2 Chromatograms of standard materials and spiked sample

由图2可见，11种物质在18min内得到较好的分离，回复初始流动相平衡至25min，进样重复性较好。色谱条件满足分析要求。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系及检出限、定量限 配制11种荧光增白剂的混合标准工作溶液，浓度为25、150、275、400、500ng·mL-1。以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限。相关结果见表2。

由表2可见，11种荧光增白剂在25～500ng·mL-1范围内相关系数均大于0.999，线性关系良好。检出限为0.12～0.24mg·kg-1，定量限为0.40～0.80mg·kg-1，满足分析要求。

表2 回归方程、相关系数、检出限和定量限Tab.2 Regression equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification

2.3.2 回收率和精密度 选取3种具有代表性的生活用纸进行加标回收实验，这3种生活用纸与口腔或食品直接接触，人体暴露风险较大。分别进行低（4mg·kg-1）、中（15mg·kg-1）、高（40mg·kg-1）3个水平的加标，每个水平平行进行6次实验，结果见表3。所有加标回收样品均不含11种荧光增白剂。

表3 回收率和精密度（n=6，%）Tab.3 Results of recovery and precision（n=6，%）

由表3可知，各物质的平均回收率在95.0%～102.5%，相对标准偏差（RSD）在1.16%～5.07%，满足检测要求。

2.4 实际样品的测定

从本市市场上采集餐巾纸、湿巾纸、卫生纸、抽纸、食品包装用纸共30件，其中一件食品包装用纸检出荧光增白剂C.I 353，含量为10.82mg·kg-1，阳性样品色谱图见图3。故本方法适合实际样品的测定。

图3 阳性样品色谱图Fig.3 Chromatogram of positive sample

3 结论

本文建立了以40%乙腈水溶液为提取溶剂，高效液相色谱荧光法同时测定生活用纸中11种双三嗪氨基二苯乙烯类荧光增白剂的分析方法。该方法前处理快速简便，回收率和重现性较好，检出限低，分析速度快，干扰少，适合于生活用纸中11种荧光增白剂的测定。