SPF种蛋内控质量检测体系的建立

刘兴刚，张文芳，张丹丹，崔松奇，田春利，余海涛，张 娜

(豪威生物科技有限公司，天津 301700)

0 引言

SPF种蛋作为各类疫苗生产的主要原材料，其质量的好坏对产品的有效性与安全性具有决定性的影响。许多蛋传疾病，如网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽贫血病毒(CAV)等可造成免疫抑制，从而导致鸡群免疫失败。如果使用有蛋传病毒的原材料生产活疫苗或减毒疫苗，会造成对疫苗的污染，进而造成接种鸡群的感染。蛋传疾病大多数有水平传播的能力，可在鸡群中扩散。如种禽群感染，再通过水平传播和垂直传播，后代的蛋传疾病将无法控制[1]。因此需要对SPF种蛋进行质量监控，建立一套有效的种蛋质量控制体系，以降低生产疫苗的外源污染风险[2]。

1 材料

SPF种蛋：北京(A)和山东(B)两家供应商种蛋。

其他蛋：由市场购买的普通蛋、品牌1、品牌2的受精蛋和已知阳性鸡群的非受精蛋。

孵化箱：海江孵化设备厂。

ELISA试剂盒：美国爱德士(IDEXX)生物科技有限公司。

高速离心机：Thermo ，Legend Micro 17R。

酶标仪：赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，multiskan MK3。

PCR试剂盒：北京全式金生物技术有限公司。

PCR仪：Applied Biosystems公司。

琼脂糖(西班牙)：北京康润诚业生物科技有限公司。

电泳仪：Tanon天能，EPS300。

凝胶成像仪：BioDoc-It® Imaging System美国UVP。

2 实验方法

2.1 种蛋的常规检测

外观与洁净度评价，表面应洁净且无砂皮、畸形、破损，蛋形指数0.7～0.8(横径/纵径)，不合格率应小于2%。

蛋重，每批种蛋随机抽取30枚称重，重量在50～70 g/枚为合格。

孵化率，38 ℃孵化至10日龄，去除无精蛋与死胚，孵化率应不小于90%。

2.2 4种蛋传病毒的ELISA法检测

2家SPF种蛋供应商的种蛋每批随机抽样30枚，同时从市场上抽取样本作为对比。分别对网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、禽贫血病毒(CAV)、禽呼肠孤病毒(REO)4种蛋传病毒进行检测[3]。

2.2.1 样品处理

蛋清样品，敲开蛋壳，吸取1 mL蛋清于离心管中，反复冻融3次作为被检样品。提取卵抗，离心管中先加入0.6 mL生理盐水。

1)直接提取法。取0.6 mL卵黄与生理盐水混合均匀，4 ℃静置24 h后，收集上清液，3 000 r/min离心5 min，-20 ℃冰箱保存备用。

2)氯仿提取法。0.3 mL卵黄加入0.6 mL生理盐水中，再加900 μL 氯仿，充分振荡后，37 ℃水浴30 min，期间摇晃2～3次，然后4 000 r/min离心20 min，取上层水相，即为卵黄抗体待检样本[4]。

2.2.2 4种蛋传病毒的检测

2.2.2.1 网状内皮组织增生症病毒(REV)的检测

据SPF鸡血清REV检测方法，采取直接提取卵黄与氯仿提取，用美国IDEXX公司的REV-Ab ELISA检测试剂盒分别检验[5]。检测之前用样品稀释液将被检样品进行500倍稀释。

2.2.2.2 禽白血病病毒(ALV)的检测

ALV抗原检测，取蛋清样品直接加样，按照ELISA诊断试剂盒操作程序进行。ALV-A、B亚群及J亚群抗体检测，取卵黄抗体样品，用稀释液将被检样品进行500倍稀释，按照ELISA诊断试剂盒操作程序进行。

2.2.2.3 禽贫血病毒(CAV)的检测

建立酶联免疫吸附试验检测SPF种蛋鸡传染性贫血病毒抗体方法。卵黄抗体采取直接提取法和氯仿提取法分别检测，卵黄抗体做10倍稀释，按照ELISA诊断试剂盒操作程序进行。

2.2.2.4 禽呼吸肠孤病毒(REO)的检测

卵黄抗体采取直接提取法和氯仿提取法分别检测，卵黄抗体500倍稀释，按照ELISA诊断试剂盒操作程序进行。

2.3 4种蛋传病毒的PCR方法检测

2.3.1 引物合成

根据GenBank公司已登录的蛋传病毒序列设计相应引物，由上海生物工程有限公司合成。

2.3.2 样品制备

每组鸡蛋随机取10枚，孵化至10日龄，制备成鸡胚成纤维细胞，作为一个混合样品，培养7 d进行一次传代，继续培养7 d后冻融2次，采用PCR 法检测培养的细胞中是否存在相应病毒特异性基因。

2.3.3 DNA/RNA提取

按提取试剂盒操作程序进行，提取DNA/RNA。

2.3.4 反转录(ALV、REO)

按顺序加入10 μL 2xES Reaction Mix，1 μL Random primer(N9)，1 μL Easy ScriptRT/RI Enzyme Mix，8 μLRNA 。轻轻混匀，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 s失活。

2.3.5 PCR反应

1)按顺序加入37 μL dd H2O，4 μL 2.5 mM dNTPs，5 μL 10 X EasyTaq Buffer，1 μL Forward Primer(10 μM)，1 μL Reverse Primer(10 μM)，混合均匀后分装24 μL/管，每管加入0.5 μL模板，0.5 μL DNA聚合酶。

2)检测4种蛋传病毒的反应程序具体如表1、表2、表3所示。

表1 ALV、CAV检测反应程序

表2 REV检测反应程序

表3 REO检测反应程序

3 结果

3.1 种蛋质量的常规检验结果

种蛋质量的常规检验结果，如表4所示。

表4 种蛋质量的常规检验结果

检验结果表明，2家供应商的SPF种蛋从外观、蛋重、孵化率几方面评价，符合公司对SPF种蛋质量的一般要求。

3.2 4种蛋传病毒的ELISA检测结果

1)对2家供应商的SPF种蛋进行检测，卵黄抗体采用直接提取法，ALV抗原采用蛋清样品检测。结果如表5所示。

表5 直接提取法SPF种蛋检测结果

4种蛋传病毒采用ELISA法检测，结果12批次SPF种蛋全部为阴性，阴、阳性对照成立，实验结果成立。说明2家供应商的SPF种蛋无上述4种蛋传病毒感染。

2)对市场购进的普通蛋、品牌蛋以及已知阳性鸡群的鸡蛋进行检测，对卵黄抗体采用直接提取法，ALV抗原采用蛋清样品检测。检测结果如表6所示。

表6 市场购买蛋直接提取卵黄抗体检测结果

市场购买蛋直接提取卵黄抗体进行检测，5批次市场购买种蛋部分阳性，已知阳性鸡群的鸡蛋阳性检出率较高，试验阴、阳性对照成立，实验结果成立。

3)采用直接提取法与氯仿提取卵黄抗体，CAV、REV、REO的检测结果对比如表7所示。直接提取法与氯仿提取CAV、REV、REO卵黄抗体的检测对比，结果差异不明显。

表7 直接提取法与氯仿提取CAV、REV、REO卵黄抗体的检测结果

4)采用直接提取法与氯仿提取卵黄抗体，ALV的检测结果对比如表8所示。直接提取法与氯仿提取ALV卵黄抗体的检测相对比，结果差异不明显。

表8 直接提取法与氯仿提取ALV卵黄抗体的检测结果

3.3 4种蛋传病毒的PCR检测结果

4种蛋传病毒的PCR检测结果如表9所示。

表9 PCR法检测结果

PCR检测阴性对照、阳性对照成立，实验结果成立。ELISA 法检测阴性的12批SPF种蛋孵化成鸡胚制备的鸡胚成纤维细胞PCR法检测结果也均为阴性，ELISA检测阳性的种蛋，对应批次种蛋PCR检测也为阳性，2种检验方法的检测结果符合率较好。

电泳结果如图1～4所示。

图1 REV检测结果

图2 CAV检测结果

图3 REO检测结果

图4 ALV-B亚型检测结果

4 讨论

4.1 种蛋的常规检测

检验结果表明，2家供应商的SPF种蛋从外观、蛋重、孵化率几方面评价，符合对种蛋质量的一般要求。该检验方法简单可行，可用于种蛋质量的日常监测。

4.2 4种蛋传病毒的ELISA法检测

4种蛋传病毒采用ELISA法检测，结果12批次SPF种蛋全部为阴性，5批次市场购买种蛋部分阳性，已知阳性鸡群的鸡蛋阳性检出率较高，试验阴、阳性对照成立，实验结果成立。ELISA法检测4种蛋传病毒，技术成熟可靠，方法简单快速，可应用于实际工作中的种蛋质量监测。

卵黄抗体直提法和氯仿提取抗体的方法在检测结果上差异不明显。直提法有操作易行、检测周期短、工作效率高的特点，可作为优选方法。

4.3 4种蛋传病毒的PCR法检测

PCR检测阴性对照、阳性对照成立，实验结果成立。ELISA 法检测阴性的12批SPF种蛋孵化成鸡胚制备的鸡胚成纤维细胞PCR法检测结果也均为阴性，ELISA检测阳性的种蛋，对应批次种蛋PCR检测也为阳性，2种检验方法的检测结果符合率较好。

用ELISA方法和PCR法均可以对种蛋的外源病毒进行检测，ELISA方法简单快速，灵敏度好。PCR方法灵敏度更高，但种蛋须孵化10 d再制备鸡胚成纤维细胞，培养14 d后再进行检验，时效性差。所以可以优先使用ELISA方法检测，发现阳性或可疑的结果可使用PCR复检。

5 结论

本试验对种蛋外观、蛋重及孵化率的检测方法简单可行，可用于种蛋质量的日常监测。ELISA方法和PCR法对4种蛋传病毒的检测，实验结果均成立，且检测结果符合率较好。优先使用ELISA方法用于种蛋质量检测，方法简便，时效性好，若发现阳性或可疑的结果可使用PCR复检。本试验建立了一套在实际工作中可操作性强、结果可靠的种蛋质量检测方法，可以对SPF种蛋质量进行有效把关，进而更好地保证疫苗产品质量，降低生产风险。