魔芋病毒病研究进展

刘 欢，何 斐，李 川

（安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

魔芋（Amorphophallus rivieri）属于天南星科（Araceae）魔芋属（AmorphophallusBlume）多年生草本植物，因其能提供大量的葡甘聚糖，且含有多种人体必需的微量元素，广泛应用于食品、药品、农业化工等领域，被誉为“长寿食品”，具有很好的保健功效[1]。我国是魔芋栽培大国，面积和产量均居世界首位。传统的魔芋稀疏种植在树阴下，病害较少，随着魔芋规模化种植的推广，栽培面积不断扩大，为病害的发生和流行提供了有利条件。国内外魔芋主产区的真菌、细菌和病毒病害发生普遍[2]。相对于真菌和细菌病害，魔芋病毒病研究最为薄弱，而无性繁殖对于魔芋栽培非常重要，因此，病毒传播几乎是不可避免的，久而久之导致病毒积累，种性退化；另外，因魔芋长期受各种病毒侵染，导致自身抗性降低，加剧了白绢病、软腐病和一些生理病害的发生流行，最终导致产量降低、品质下降，一些地块甚至绝收，严重制约了魔芋种植业乃至整个产业的发展[3]。

本研究对现阶段魔芋病毒病害的研究现状进行了分析，从病原学、发生情况、检测技术等方面进行归纳，并提出病毒病控制方法，分析魔芋病毒病研究中急需探明的科学问题，指出下一步研究方向，倡导重视魔芋病毒病害的发生蔓延，旨在为魔芋病毒病的深入研究提供参考依据。

1 魔芋病毒病病原种类和发生情况

1.1 魔芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）

DsMV是马铃薯Y病毒科（Potyvirus）马铃薯Y病毒属（Potyviridae）成员，基因组为正义单链RNA（+ssRNA），全长约10 kb，仅编码一个大的多聚蛋白，通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成P1、HC-PRO、P3、6K1、CI、6K2、Via-VPg、Nia-Pro、NIB和CP等10个具有功能的蛋白[4]。病毒全基因组序列是开展其致病机理、病毒与寄主相互作用、基因功能和致病性等相关研究的基础信息，然而，GenBank中DsMV全基因组序列大多来自同科植物马蹄莲和芋头，DsMV魔芋分离物全基因组信息却鲜有报道。

DsMV主要侵染天南星科植物，也是天南星科植物最重要的病毒病，其侵染对作物并不是致命的，但会延缓农作物生长并降低产量，DsMV发生严重时，可能会导致某些天南星科植物50%的产量损失[5]。对于魔芋来说，DsMV主要依靠种芋进行远距离传播，而在田间主要由蚜虫以非持久性方式传播给健康植株，传播速度非常快，此外，汁液摩擦也可以传毒[6]。

日本是全球魔芋种植的第二大国，对魔芋病毒病的研究起步较早，日本学者20世纪70年代在表现为花叶症状的魔芋植株中检测到DsMV[7]。随后到90年代，巴西科学家发现魔芋病毒病，受害叶片表现出花叶和畸形症状，有些植株块茎变小，经过宿主范围、形态学、细胞病理学和血清学特征鉴定，确定病原为DsMV，这也是DsMV浸染巴西魔芋的首次报道[8]。

国内学者陈集双等[9]于20世纪90年代在杭州栽培的魔芋上检测到DsMV，并对其组织病变进行了研究，结果在电子显微镜下发现细胞中存在较多的风轮状内涵体（pinwheel inclusion body，PW），而这一特征在感染DsMV的植物体内是普遍存在的。2007年，胡晓等[10]在湖北恩施自治州栽培的魔芋中检测到DsMV，其叶片表现出皱缩、褪绿和斑纹症状。之后到2008年，在安徽六安市各县区栽培的魔芋中通过血清学检测到DsMV，10份叶片样品中病毒感染率达70%[11]；同年，云南省昆明市嵩明县栽培的花魔芋中发现一些植株叶片表现出典型的病毒病症状，且发生率较高，罗延青等[12]分离得到一个病毒分离物YN80，植株叶片症状为花叶、畸形和皱缩，经形态学和细胞病理切片观察到明显的PW，属于典型的Potyvirus成员，后经血清学、RTPCR和基因测序分析，最终将YN80确定为DsMV的一个分离物。2021年，笔者在陕南秦巴山区采集了多份魔芋叶片样品，通过RT-PCR检测到DsMV，结果发现，DsMV在安康各魔芋栽培区广泛发生，受害植株叶片表现为严重的褪绿斑块、黄化、畸形和卷叶症状（图1）。

图1 受DsMV感染的魔芋植株症状Fig.1 Symptoms of konjac plants infected with DsMV

1.2 魔芋花叶病毒（Konjak mosaic virus，KoMV）

KoMV分类地位与DsMV一致，均属于马铃薯Y病毒科（Potyvirus）马铃薯Y病毒属（Potyviridae）成员，但二者没有明显的血清学关系。20世纪90年代，KoMV首次在日本群马栽培的魔芋中分离到，能够引起魔芋花叶症状[13]。随后，日本学者测定了KoMV魔芋分离物全基因组序列，并对其生物学特性进行了初步研究，结果发现，KoMV病毒粒子为弯曲棒状，长800～900 nm、宽13 nm。通过汁液摩擦接种至5科17种植物中，仅有3种天南星科植物感染了该病毒，这表明KoMV的寄主范围很窄。同时该研究发现，KoMV可通过棉蚜以非持久性的方式通过传播，亦可通过魔芋球茎进行传播[14]。

2000年，方琦等[15]在云南曲靖、玉溪、楚雄等地采集了大量魔芋样品，使用负染法在一些样品中观察到类似于KoMV的病毒粒子形态，但没有经过分子检测鉴定，在GenBank中也没有发现KoMV中国魔芋分离物序列信息，仅有来自中国云南省曲靖市沾益区的KoMV当归分离物全基因组序列（Accession number：MK770338）。由于 KoMV 在魔芋中的研究报道非常有限，尚不清楚KoMV侵染对魔芋品质和产量造成的影响。

1.3 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）

CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[16]。基因组包括3个单链正义基因组RNA（RNA1、RNA2和RNA3），共编码 5个蛋白（1a、2a、2b、MP 和 CP）。其中，1a蛋白由RNA1编码，是病毒重要的复制酶组分，具备RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）的活性，也是影响寄主症状的重要因子；2a蛋白由RNA2编码，与1a蛋白共同完成病毒的复制，同时影响寄主症状的发展；2b蛋白是一个基因沉默抑制子，由RNA2的亚基因组RNA4A编码；MP由病毒的RNA3编码，负责病毒在细胞间的移动以及长距离运输；CP由病毒来源于RNA3的亚基因组编码，在病毒的包裹、复制、细胞间移动以及长距离运输中都起到非常关键的作用，同时也是病毒最重要的症状决定因子[17]。有些CMV 除基因组RNA以外还携带非编码的卫星RNA（satellite RNA，satRNA），CMV的卫星RNA可以显著地改变CMV致病性，加重或减弱寄主症状，这取决于卫星RNA和宿主物种[18]。CMV在密歇根州和纽约首次被发现，之后世界各国相继报道，CMV侵染不同寄主植物，并已确定为几种病毒病流行的致病因子[19]。其寄主范围超过1 100种植物，造成的经济影响非常大，CMV被列入“十大植物病毒”，排名第4[20]。CMV往往能在寄主植物上产生严重症状，多表现为花叶、矮化或畸形等[21]。由于CMV多侵染作物，且大多数作物种质中缺乏抗性基因，因此也是目前研究较广的植物病毒之一[22]。

20世纪90年代，日本学者通过免疫扩散法首次在魔芋中检测到CMV，受害植株生长迟缓，同时表现为小叶坏死和叶柄矮小症状，病毒可通过蚜虫和机械接种传播，但不能通过魔芋球茎传播，日本科学家建议将该病命名为魔芋坏死性矮小症（konjak necrotic stunt disease），随后通过病害调查发现，CMV和KoMV是日本魔芋栽培中的主要病毒病原[23]。

我国自2000年开始，在云南魔芋主栽区进行了病毒病调查鉴定研究，通过电子显微镜检测到直径28 nm的球形病毒粒子，样品经负染色后观察到电子致密中心结构，属于典型的CMV病毒粒子特征[24]，受害植株叶片表现为黄化和花叶症状[15]。2015年，盛佳婧等[25]研究发现，可将CMV辣椒分离物通过机械摩擦接种至魔芋，接种7 d后，魔芋植株出现卷叶症状，并通过RT-qPCR检测确认，但相对于其他寄主，CMV在魔芋中病毒含量较低。

1.4 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）

TSWV是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，病毒粒子为扁球状，在80～120 nm[26]。基因组由3个单链RNA组成，其中L基因组为负义RNA，编码RNA依赖的RNA聚合酶，与病毒复制相关[27]；M基因组为双义RNA，病毒链编码一个参与细胞间运动的非结构蛋白（NSm），病毒互补链编码2个糖蛋白（GPs）的前体[28]；S基因组同为双义RNA，病毒链编码一个具有基因沉默抑制因子功能的非结构蛋白（NSs），而病毒互补链编码核衣壳蛋白（N）[29]。

TSWV于1915年在澳大利亚首次被发现，现已蔓延至多个国家，1989年传入我国广州[30]，主要由蓟马持久传播，目前至少发现9种蓟马可传播该病毒，少数情况下，TSWV也可通过汁液传播[31]。TSWV能引起寄主植物各种症状，包括叶片、茎和果实上的局部坏死和斑点，致使果实失去商品价值[32]。据统计，全世界每年因TSWV侵染农作物导致的损失估计超过10亿美元[33]。因其分布在世界各地、具有广泛的寄主（＞800种植物）、侵染作物导致重大经济损失以及难以控制的虫传介体等特征[34-35]，被列在十大植物病毒中，排名第2。在其报告近1个世纪后，全球经过30余年的科研攻关，TSWV仍然是最具经济破坏性和科学挑战性的植物病毒之一[20]。

魔芋中TSWV的报道非常少，仅我国学者通过制作超薄切片，利用电子显微镜在魔芋植株中观察到典型的TSWV病毒粒子分布，该样品来自云南，受害植株叶片表现为墨绿色[15]。

1.5 其他潜在的病毒

2005年6—9月，吴祝平[36]在湖北一些地区开展了魔芋病害调查研究，共发现了12种病害，其中包含病毒病，受病毒侵染的魔芋植株表现为矮化、叶片畸形；2016年，杞和平[37]在云南大姚县发现魔芋病毒病，感病植株有矮化现象，且叶片初期表现为褪绿，后期逐渐黄化，但均未报道具体的病毒种类，由于植物病毒侵染引起的寄主症状往往比较相似，仅通过症状表现很难判断具体是哪一种病毒感染。近期，笔者在陕南秦巴山区发现魔芋栽培区病毒病的发生非常严重，植株症状表现各异，主要有叶边缘褪绿、花叶、黄化、卷叶、窄叶和畸形等（图2），相关病毒正在进一步鉴定中。

图2 魔芋病毒病症状Fig.2 Symptoms of konjac viral disease

魔芋地理分布广泛，种芋在不同地区进行频繁运输交换，导致病毒的广泛传播和地理分化，随着魔芋产业快速发展，加之天南星科植物病毒种类繁多，某些科目病毒检测和鉴定又非常复杂，在后续科研攻关中将会有更多侵染魔芋的新病毒种类被发现。

2 魔芋病毒病检测技术

植物病毒及其所致病害对各种农园作物的为害日趋严重且防治困难。病毒病大多为系统性侵染，魔芋一旦感病便会蔓延到全株，这就带来了防治上的困难。多年来，人们针对不同病害进行了许多探索，但是，对大多数病毒病还很难防治，也没有一个或一套通用、有效的方法。为了确保魔芋能进行持续稳定生产，无毒种苗与植物组织脱毒技术成为预防病毒病的关键方法，而魔芋病毒的检测技术是防治病毒病最基本的前提。随着分子实验技术的不断完善，魔芋病毒病的检测方法越来越趋于快速、高效。

2.1 电子显微镜检测

电子显微镜的诞生促进了植物病毒学的研究，德国科学家利用电镜证实了烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的杆状形态[38]。之后，生命科学领域开始广泛应用电子显微镜技术，电镜的应用为病毒形态与结构的研究提供了强有力的工具，开创了病毒形态与结构研究的崭新局面，用电镜可直接看到病毒粒体的外形、大小及内外表面的构造[39]。

由于电镜技术对操作人员的专业要求很高，而且仪器昂贵，检测周期长和检测样本的数量有限等问题，在植物病毒的检测应用中并不广泛，取而代之的是血清学和分子检测。但这并不意味着电子显微镜不具有应用价值，随着现代化农业种植结构的不断优化，新的病毒不断被发现，对于新病毒的存在与病毒粒子的直观性观察，电子显微镜发挥的作用仍然是其他检测技术不可替代的[40]。

2.2 生物学检测

生物学方法是植物病毒检测的传统方法，操作简单。我国很多学者曾利用生物学检测方法对天南星科植物病毒进行初步鉴定。魔芋病毒可通过一些草本指示植物鉴定，比如利用黄瓜、西方烟、本氏烟等草本植物鉴定DsMV和CMV，将病组织通过汁液摩擦接种至草本寄主，大约13 d后，指示植物叶片出现褪绿点，叶片皱缩等症状[41]；利用矮牵牛、三生烟也可以鉴别TSWV，病毒汁液接种矮牵牛后叶片出现褐色斑点，接种三生烟则显示为叶片局部坏死点并伴有系统症状[42]。生物学检测方法虽然耗时长，但它作为植物病毒学研究中的最经典、常用的实验方法，在运用其他病毒检测方法前先利用生物学检测进行初步筛选鉴定，可以减少工作量。

2.3 血清学检测

在20世纪60年代就有了血清学检测病毒的报道，随着植物病毒学和生物化学研究技术的不断完善，这种方法已经成为检测鉴定病毒病的基础方法。DsMV、KoMV、CMV和TSWV这4种侵染魔芋的病毒早已制备出抗血清，对于田间魔芋病毒病大面积普查具有重大意义。中国学者基于血清学原理已经制备出DsMV和CMV检测试剂盒[43]，可对大量样品进行检测，具有高效率、简便、无需大型仪器设备等优点。基于血清学检测TSWV更快速方便，潘慧等[44]制备了TSWV多克隆抗体，可用于田间病株的病害诊断，具有一定的应用开发前景。由于KoMV在中国报道较少，在国内尚未发现KoMV血清学检测应用，但其作为日本魔芋栽培中的常发病毒，KoMV抗血清在当地的应用也较为普遍[14]。相对于传统的生物学检测和电镜检测，血清学技术简化了检测流程，具有快速、易操作等特点，虽然检测灵敏度相比分子检测略低，对于病害的分布与大范围调查研究，血清学的应用最为广泛。

2.4 分子生物学检测

分子生物学技术是以DNA或RNA为研究基础，对植物病毒进行检测鉴定的方法。分子检测取样方便，在受害作物任何部分收集样品，均可以通过分子方法准确检测。以4种魔芋病毒外壳蛋白（Coat protein，CP）为靶标基因，通过多重比对，在cp基因保守区设计用于RT-PCR检测的引物，为魔芋病毒病的准确检测鉴定提供了技术支持[45-46]；针对DsMV、CMV和TSWV这3种病毒，RT-qPCR检测体系也非常成熟[47-48]，通常比普通RTPCR灵敏度高10～100倍。此外，可根据魔芋生长的不同时间、不同部位采取高效的分子生物学检测方法。在植物病毒检测方面，分子生物学是不可或缺的核心技术。对于病原的检测，除了我们常用到的传统PCR技术，目前已有很多新的技术基于常规PCR优化而来，如核酸酶保护试验（Ribonuclease protection assay，RPA)，环 介 导 等 温 扩 增 技 术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）以及多重PCR（multiplex PCR）等技术，在协助检测鉴定魔芋病毒病害方面有一定的应用潜力。

3 魔芋病毒病防控建议

对于病毒病目前防治较难，主要体现在作物一旦发生病毒病便终身带毒，另外魔芋主要依靠无性繁殖，病毒易通过种芋不断积累传播，加之多种病害复合侵染，为魔芋产业带来严重的威胁。病毒病防控可以从以下几个方面考虑：第一，从正规经销商购买种芋，确保种芋健康，避免病毒远距离传播，是最有效的防治方法。第二，倡导魔芋保健栽培，合理的水肥管理以及田间规划，可以提高植株自身抗逆性。第三，在蚜虫和蓟马盛发前期，选择高效杀虫剂杀灭可能的传毒介体，阻断病毒在田间交叉传播感染。常用杀虫剂有吡蚜酮、啶虫脒、高效氯氟氰菊酯、苦参碱等，推荐化学农药+生物农药组合施药，避免长期单一用药；有条件的地块也可以悬挂黄板或蓝板对虫传介体进行诱杀，根据魔芋栽培面积和种植密度，合理规划诱虫板悬挂高度和田间布局。第四，对于田间魔芋表现出轻度花叶、褪绿、卷叶等病毒病症状的可以予以抗病毒治疗，常用的植物免疫调节剂可选择宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖素等药剂，按照药剂推荐浓度进行防治，可以减轻由病毒侵染导致的产量和质量损失。如果发现严重的植株矮化、黄化、畸形等，建议清除病株，带出田间集中深埋处理。

4 魔芋病毒病研究中急需解决的问题

魔芋病毒病仍处于初步研究阶段，根据研究现状，其在生物学特性、发生规律和防控技术上有很多工作需要进一步完善：第一，导致魔芋病毒病害间歇性发生流行的侵染来源和关键因子尚不清楚，防治上缺乏针对性措施；第二，中国魔芋主栽区从未有过系统取样调查研究，各个主栽区主要病毒株系类型、变异动态和发生消长规律缺乏系统监测，给预测预报和抗病育种工作带来很大的盲目性；第三，主要病毒群体尚不明确，病毒长期潜伏侵染或多种病毒复合侵染导致魔芋自身抗性降低，进一步加重“两病”的病情指数和发病程度，导致防治难、危害损失严重；第四，配套的防控技术体系尚不成熟，对于田间可能存在的病毒传播介体、传播规律尚不清楚；第五，当前魔芋品种对侵染魔芋的主要病毒的抗性不清楚，需开展系统的抗性评价，为抗病育种提供参考依据。

5 总结与展望

近年来，随着葡甘露聚糖不断被开发应用，魔芋在食品、医疗、化工及保健品市场上的占有量逐年扩大，随之而来的是种植面积不断增加，品种更替加快，被称为“植物癌症”的各种病毒病逐渐成为制约魔芋产业发展的关键因素。由于魔芋栽培主要集中在中国和日本，有关魔芋病毒病害的研究在国际上鲜有报道。为确保魔芋能进行优质、丰产、持续性的生产与提高，必须重视并做好魔芋病毒病相关研究，为病毒病的治理提供新方法，新思路。未来研究可以从这几个方面予以考虑：第一，天南星科作物病毒病种类繁多，造成的损失严重，魔芋病毒病种类应该远不止已报道的这4种，可以利用新一代测序技术，系统鉴定魔芋病毒种类；第二，在已报道的4种病毒中，除KoMV研究较少，暂不清楚其为害特性，TSWV、CMV和DsMV已经在天南星科其他作物中造成严重为害，发生地块农作物损失严重，摸清魔芋主栽区优势病毒的分布、发生率，确定关键病毒已刻不容缓，对关键病毒分子致病机制开展科研攻关，为抗病毒育种提供重要依据；第三，由于一些常规检测技术很难准确检测低丰度病毒样本（如休眠种芋），需要建立高灵敏度魔芋病毒检测技术，对阻止病毒随繁殖材料远距离传播有重要意义；第四，对魔芋主要病毒生物学特性、传播途径、群体遗传结构、株系分化等开展持续性研究，有助于建立病害预测预报模型，推动魔芋病毒病防治工作；第五，利用植物组织脱毒技术对魔芋病毒进行清除，建立无毒种苗基地，同时也可对目前已有的魔芋品种开展抗病毒检测鉴定，挖掘抗病毒品种和资源，可以很好地解决或降低由病毒感染带来的品质和产量损失。

魔芋已成为我国云南、湖北、四川、贵州和陕西山区经济发展、村民增收的支柱产业，积极做好魔芋病毒病科学研究和技术攻关，为决胜脱贫攻坚、同步全面小康、推进乡村振兴作出新的贡献。