西门塔尔牛无角性状的分子鉴定及应用

郝琴琴，任 静，成俊丽，朱芷葳，许冬梅，贾雪纯，李鹏飞

（山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）

西门塔尔牛是目前我国广泛的大型乳肉兼用品种，具有产奶量高、适应性强和繁殖率高等优点[1]。自引进以来，西门塔尔牛对本地黄牛改良效果显著，目前已形成我国西门塔尔牛各品系。在集约化养殖过程中发现，有角西门塔尔牛易对饲养人员造成伤害，同时牛角也降低牛对营养物质的利用程度[2-3]。因此，培育西门塔尔牛无角品系具有一定的实际意义。

GEORGES等[4]利用微卫星标记首次将牛无角基 因 定 位 于 BTA1（Bovine chromosome 1）上 。DRÖGEMÜLLER等[5]进一步将控制该性状的基因（突变位点）定位到BTA1上1 Mb区域内。MEDUGORAC等[6]利用高密度基因芯片对夏洛莱、西门塔尔、荷斯坦等多个品种的无角性状进行研究，结果发现，该性状由6个位点控制，其中，荷斯坦牛的无角性状是由PF基因内P5ID、PG1654405A、PC1655463T、PC1768587A、P80kbⅡ等 5 个紧密连锁的 SNP 位点所控制；西门塔尔等其他品种的无角性状大多由P202ID位点控制，该位点是由BTA1上与PC基因紧密连锁的IFNAR2和OLIG1间一个202 bp的插入缺失突变所导致。ASAI等[7]研究表明，一些控制牛无角性状的基因座还存在于BTA19，但目前只在夏洛莱牛中可检测到，其精细定位情况和遗传机制尚不清楚。近年来，研究人员通过对不同品种无角性状突变位点的检测和成因进行分析，并已培育出一些无角新品系。尚嵩洋等[8]检测了182头无角辽育白牛和4头夏洛莱牛P202ID和P219ID突变位点，结果发现，93.96%的无角个体携带有P202ID位点，所有样本中均未检测出携带2种突变的个体，但无角夏洛莱牛则全部携带P202ID位点。谷明娟等[9]鉴定了48头无角蒙古牛P219ID突变位点。CHEN等[10]对48头无角和16头有角的四川牛进行鉴定，结果发现，该群体中存在P202ID、P219ID和P80kbID等3个突变位点。对于引入我国的西门塔尔牛各品系，目前尚无控制其角性状基因和突变位点的报道。

本研究采用PCR-测序技术对30头西门塔尔种公牛和78头种母牛的P202ID位点进行检测，并通过卡方检验进行关联分析，旨在对西门塔尔牛角性状的遗传规律进行阐释、探讨西门塔尔牛角性状的分子机制，为西门塔尔牛无角品系的培育提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 样品采集

采集西门塔尔牛颈静脉血（EDTA抗凝）108份（其中，鼎宝牧业有限公司24份，广利养殖29份，全泽农林牧专业合作社25份，天河牧业30份），无角安格斯牛颈静脉血（EDTA抗凝）5份（天河牧业），置于-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取西门塔尔牛和安格斯牛全血DNA，采用核酸定量仪（赛默飞世尔（中国）有限公司）检测DNA样品的浓度和纯度。

1.2.2 PCR-测序 P202ID引物序列引用文献[6]，具体序列如表1所示。PCR扩增体系为12.5 μL：模板 DNA 1.0 μL，2×Reaction Mix 6.25 μL，上下游引物各 0.2 μL，ddH2O 4.85 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 40 s，59 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 30 s，32个循环；72 ℃终末延伸 10 min。PCR产物采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 P202ID引物序列Tab.1 The primer sequence of P202ID

选取不同基因型样本的PCR扩增产物切胶后回收，回收产物纯化后连接至pGM-T载体（连接反应体系为 10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，pGM-T 载体 1.0 μL，连接反应 DNA 片段 3.0 μL，ddH2O 4.0 μL，16 ℃过夜连接），并转化感受态细胞Top10（天根生化科技有限公司），将感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素（Amp）的LB固体琼脂培养基上，37 ℃培养16 h，挑取每种基因型3个白色阳性菌落进行菌体PCR并测序（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0软件对所有检测个体角性状与P202ID突变位点进行关联分析，计算其PC基因和prs基因的基因频率和基因型频率；采用交叉表进行卡方（χ2）独立性检验和显著性分析。菌液测序结果采用MEGA 7.0和Chromas软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 PCR-测序结果

有角和无角个体的测序结果如图1所示。

图1 有角和无角个体的测序结果Fig.1 Sequencing results of horned and hornless individuals

提取DNA后进行PCR扩增，并对不同基因型个体的扩增产物进行切胶测序，结果显示，野生型（有角）在369 bp处有一条扩增带，突变型（无角）在571 bp处有一条扩增带，杂合子（有角）则在571、369 bp处有2条扩增带。采用MEGA 7.0软件对测序结果进行多序列比对，结果表明，相比野生型，突变型PC基因内可检测出大小为202 bp的插入序列（图1）。

2.2 PCR扩增结果

图2为103头无角西门塔尔牛、5头有角西门塔尔牛和5头无角安格斯牛PC基因的扩增结果，在103头无角西门塔尔牛中可检测到基因型为PC/PC的无角纯合子以及基因型为PC/prs的有角杂合子。

如图2所示，4头无角西门塔尔牛为纯合子（其中，公牛3头、母牛1头），82头无角西门塔尔牛为杂合子（其中，公牛22头、母牛60头），17头表型无角西门塔尔牛与5头有角西门塔尔牛基因型一致，均为prs/prs，结合其培育历史，推测这些样本为去角牛。所检测的108头西门塔尔牛基因型与其角性状完全一致。

图2 西门塔尔牛与安格斯牛PC基因P202ID位点的分子检测结果Fig.2 Molecular detection results of P202ID site of PC gene in Simmental cattle and Angus cattle

2.3 P202ID位点的基因频率和基因型频率

对西门塔尔牛PC基因中P202ID突变位点的基因频率和基因型频率进行统计分析，结果如表2所示，无角基因（PC）频率为0.416 6，有角基因（prs）频率为0.583 4；纯合无角牛PC/PC基因型频率为0.037 0，杂合无角牛PC/prs基因型频率为0.759 3，纯合有角牛prs/prs基因型频率为0.203 7。所检测样本中，共有79.63%的个体为无角牛，20.37%的个体为有角牛，结合基因型判断，鉴定成功率为100%。对基因型与角性状进行卡方检验后发现，P202ID位点的基因型与西门塔尔牛角性状具有显著关联关系（χ2=20.49，P＜0.001）。因此，可利用P202ID位点鉴定西门塔尔牛有角与无角性状。

表2 西门塔尔牛P202ID位点的PCR结果Tab.2 PCR results of P202ID site in Simmental cattle

3 结论与讨论

角是牛的重要物种特征，也是其在自然界生存斗争的主要工具[11-13]。在集约化饲养管理条件下，牛去角后攻击性减弱且增质量快，易于管理，但人工去角（如灼烧、腐蚀、切割等）会严重影响犊牛的生长发育并增加细菌感染风险[14]，而培育无角品系可避免上述危害。目前，多采用基因编辑技术获得无角个体[15]，如大通无角牦牛[16]。CARLSON等[17]和TAN等[18]利用转录激活因子类效应核酸酶（TALENs）技术将无角基因PC插入到有角荷斯坦牛胚胎成纤维细胞中，获得无角荷斯坦牛。谷明娟等[19]采用CRISPR/Cas9技术获得稳定整合P202ID位点的有角蒙古牛细胞系，为无角蒙古牛的培育提供材料。王欢[20]利用Tild-CRISPR/Cas9技术获得PC/PC纯合无角荷斯坦种公牛细胞系及其胚胎，为采用体细胞克隆技术培育无角荷斯坦种公牛奠定基础。

本研究所检测的108头西门塔尔牛P202ID基因型与角性状完全一致，鉴定成功率100%，此结果与WIEDEMAR等[21]报道一致。卡方检验结果显示，P202ID位点基因型与西门塔尔牛角性状极显著相关，证实了西门塔尔牛无角性状是由PC基因的P202ID位点突变所致。P202ID基因首次发现于凯尔特牛[22]，除在无角西门塔尔牛中检测到P202ID位点外，在蜀宣花牛、夏南牛、云岭牛中均检测到该位点。刘林海[23]对48头蜀宣花牛的无角突变位点进行分子鉴定，结果发现，39头蜀宣花牛的无角表型与P202ID突变位点相关，结合其培育历史，推测P202ID突变位点可能来源于引进品种西门塔尔牛。在对113头夏南牛[24]和269头云岭牛[25]无角性状的研究中显示，2个品种的P202ID突变位点均来源于夏洛莱牛，P202ID位点可用于我国西门塔尔牛及本地黄牛品种角性状的鉴定。

目前，控制牛角性状的POLLED位点已被广泛研究，且通过转录组测序发现，影响牛角发育的基 因 OLIG1、OLIG2、FOXL2、C1H21orf62 和RXFP2在有角和无角个体中表达量显著不同[21]，但相关候选基因和信号通路仍未被完全阐明。相比微流控芯片、竞争性等位基因特异性PCR（KASP）、毛细管电泳等技术，PCR-测序技术具有简便、准确、灵敏、成本低和适用范围广等优点[26]。颜泽等[27]通过KASP和微流控芯片检测出2头德国西门塔尔牛中存在P202ID、PC1768587A和P80kbID等3个无角突变位点，并采用PCR-测序技术进行了验证。WIEDEMAR等[21]在对欧洲西门塔尔牛进行全基因组测序后，采用PCR-毛细管电泳技术对该品种进行角性状鉴定，结果发现，大多数西门塔尔牛无角性状由P202ID位点控制。

本研究采用PCR-测序技术对无角西门塔尔牛中P202ID位点进行基因型鉴定，可为在西门塔尔群体中鉴定无角个体提供试验方法和依据，并为生产中培育无角西门塔尔牛品系奠定基础。