HPLC法测定苦柏洗剂中盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱含量

卢向红 刘利辉 汪 霞 佘林立

1.湖南省娄底市食品药品检验检测所，湖南 娄底 417100；2.岳阳新华达制药有限公司，湖南 岳阳 414000

苦柏洗剂是由岳阳市第二人民医院制剂室委托岳阳新华达制药有限公司生产的中药制剂，其处方组成为苦参、鸦胆子、黄柏、丁香、蛇床子、海马、白鲜皮、薄荷素油和艾叶。具有清热解毒，燥湿杀虫，祛风止痒的功效，临床主要用于真菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、老年性阴道炎、宫颈糜烂、湿疹及阴部瘙痒等症属湿热者[1]。处方中君药黄柏的主要活性成分为生物碱,其中盐酸小檗碱是含量最高的生物碱,可达1.4%～5.8%[2], 体外研究[3-5]表明，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱均具有较强的抗炎作用和抗菌能力以及广泛的抗菌谱。臣药蛇床子主要成分是香豆素类化合物，如蛇床子素等,蛇床子素具有抑制炎症发生、抗过敏等作用[6-7]。这三个成分是该药发挥临床疗效的主要化学成分，原标准中未对这三个成分进行质量控制，使得制剂质量难以得到有效控制。本文采用高效液相色谱法同时测定苦柏洗剂中盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的含量，制定了与临床疗效相关成分的含量控制方法，对增强药品质量可控性，保证临床用药安全性，具有十分重要的意义，为进一步提高和完善药品质量标准提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Thermo Fisher HPLC色谱仪(U3000) Chromeleon色谱工作站；梅特勒托利多 XSE205DU电子天平(十万分之一)；超声波清洗仪 KQ-300DE

1.2 试剂 水为I级纯化水，乙腈(HoneyWell，批号：T8FA1H)为色谱纯，磷酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190301)为优级纯、十二烷基硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160413)为分析纯。

盐酸巴马汀对照品购自中国食品药品检定研究院(批号：110732-201913，含量85.7%)；蛇床子素对照品购自中国食品药品检定研究院(批号：110822-202111，含量99.7%)；盐酸小檗碱对照品购自中国食品药品检定研究院(批号：110713-202015，含量85.9%)。

苦柏洗剂由受委托生产企业岳阳新华达制药有限公司生产，批号为200701、201201、210301、210701。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Zafex Acutfex PA-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：25 ℃，0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸钠)-乙腈(63∶37)，流速:1.0 mL·min-1，PDA检测器，检测波长：322 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸巴马汀对照品15.24 mg，蛇床子素对照品16.35 mg，盐酸小檗碱对照品23.80 mg，分别加甲醇制成每1 mL含盐酸巴马汀32.65 μg·mL-1，蛇床子素16.30 μg·mL-1，盐酸小檗碱817.77 μg·mL-1的溶液，作为储备液备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品3瓶内容物混匀，离心，精密取上清液10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇8 mL，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)20 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按苦柏洗剂的处方和制备工艺，分别制备缺黄柏和蛇床子的阴性样品，再按2.2.2供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 分别取对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液进样12 μL，色谱图如图1。峰形对称尖锐，基线平稳，各峰之间的分离度为2.17、3.54，达到基线分离，阴性样品在三个主峰位置无干扰峰，如图1所示。

(A)混合对照品 (B)苦柏洗剂样品

(C)缺黄柏阴性样品 (D)缺蛇床子阴性样品1.盐酸巴马汀；2.蛇床子素；3.盐酸小檗碱图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下各对照品储备液适量，稀释成含盐酸巴马汀0.6530 μg·mL-1、1.3061 μg·mL-1、1.6326 μg·mL-1、3.2652 μg·mL-1、6.5303 μg·mL-1、9.7955 μg·mL-1，蛇床子素0.3260 μg·mL-1、0.6520 μg·mL-1、0.8150 μg·mL-1、1.6301 μg·mL-1、3.2602 μg·mL-1、4.8903 μg·mL-1，盐酸小檗碱16.3554 μg·mL-1、32.7107 μg·mL-1、40.8884 μg·mL-1、81.7768 μg·mL-1、163.5536 μg·mL-1、245.3304 μg·mL-1的混合标准溶液，进样体积为10 μL，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，以各对照品的浓度为横坐标，进行线性回归。结果见表1。

表1 苦柏洗剂中盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的线性关系考察结果

2.5 精密度试验 取对照品溶液连续进样6次，每次12 μL，计算得到盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱峰面积RSD分别为：0.29%、1.01%和0.37%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号(210301)样品6份，按2.2.2项下供试品液制备方法制备，依法测定，结果盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱含量RSD分别为：1.17%、1.23%和1.79%，表明本法重复性好。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液(批号：210301)在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h分别进样12 μL，依法测定，盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱峰面积RSD分别为：0.72%、0.71%和0.34%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验 精密量取已知含量(盐酸巴马汀：2.462 μg·mL-1,蛇床子素：1.270 μg·mL-1，盐酸小檗碱：59.434 μg·mL-1)的同一样品(批号：210301)6份，各5 mL置20 mL容量瓶中，各加水5 mL，精密加入含盐酸巴马汀(8.490 μg·mL-1)、蛇床子素(4.108 mg·mL-1)和盐酸小檗碱(216.450 μg·mL-1)的混合对照品溶液1.5mL，加甲醇适量，超声处理20 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按样品测定方法测定含量，计算回收率。结果见表2。

表2 苦柏洗剂中盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的加样回收试验结果 (n=6)

表2(续)

2.9 样品测定 取四批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的含量。结果见表3。

表3 苦柏洗剂中盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 通过查阅文献[8-11],在实验过程中分别考察了0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸钠)-乙腈，甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺，乙腈-水等流动相系统及多个比例，经过反复比较，采用0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸钠)-乙腈(63∶37)进行洗脱，盐酸巴马汀、蛇床子素、盐酸小檗碱与相邻峰达到基线分离，峰形对称性好，理论塔板数均在20000以上。

3.2 检测波长的选择 苦柏洗剂中的盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的结构不同，其紫外最大吸收波长也不同。采用PDA检测器在190～400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果盐酸巴马汀和盐酸小檗碱在346 nm波长处有最大吸收，蛇床子素在322 nm波长处有最大吸收，为提高检测灵敏度，因此选择322 nm作为检测波长。

3.3 提取方法的考察 本实验对苦柏洗剂中指标性成分的提取方法进行了探索，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱属于异喹啉生物碱，蛇床子素属于香豆素类，均不溶于石油醚。分别考察了萃取和超声两种提取方法，结果显示用石油醚(30～60 ℃)萃取除杂或者用二氯甲烷提取样品，杂质成分减少，但主成分也会有所损失，且操作繁琐。取样品溶液加甲醇超声提取，结果样品中其他成分峰对主峰无干扰，结果准确、重复性好、操作简便。同时比较了不同的超声时间(10 min、20 min和30 min)，结果超声20 min样品含量最高，因此本实验选择用甲醇超声20 min的方法提取样品。

4 结论

本实验采用高效液相色谱法法测定苦柏洗剂中的盐酸巴马汀、蛇床子素和盐酸小檗碱的含量，结果准确，重复性好，专属性强，为进一步提高、完善原质量标准，更好地控制苦柏洗剂的质量提供了科学依据。