宣肺止嗽合剂中4种生物碱的含量测定方法研究

李 岩 李成明 张明童 李冬华 马 潇

1.甘肃省药品监督管理局审核查验中心，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050； 3.甘肃省药品检验研究院(甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室)，甘肃 兰州 730070；

宣肺止嗽合剂收录于2020年版《中国药典》(一部)中，由蜜罂粟壳、荆芥、前胡、桔梗等10味中药组成，具有疏风宣肺、止咳化痰之功，用于治疗风邪犯肺证咳嗽，症见咳嗽、咽痒、鼻塞流涕、恶寒发热、咯痰[1]。该制剂中含有蜜罂粟壳，其主要成分为吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱等多种生物碱成分。吗啡具有镇痛、镇咳和抑制呼吸等药理作用[2-4]，磷酸可待因、蒂巴因和盐酸罂粟碱也具有显著的止咳、镇痛作用[5]，说明罂粟壳是通过多种成分发挥作用。但是，吗啡及其其他生物碱成分连续服用易产生依赖性、瘾癖，超剂量使用会出现呃逆、呼吸困难、昏迷等中毒症状。因此，为了确保制剂的安全性及有效性，需要确定可供质量控制的特征成分，制定质量控制标准。2020年版《中国药典》(一部)对宣肺止嗽合剂含量测定项中，采用高效液相色谱(HPLC)法控制蜜罂粟壳中的吗啡含量，且前处理过程繁琐、费时，并易造成样品中生物碱的损失，同时由于样品中吗啡含量较低，其他成分对其影响较大。因此，本实验采用HPLC法同时测定宣肺止嗽合剂中4种生物碱(吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱)含量，以完善、提升宣肺止嗽合剂的质量控制标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；ME24-102型万分之一电子天平、XS205DU十万分之一型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250E数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料 吗啡对照品(批号：171201-201324，含量≥93.9%)、磷酸可待因(批号:171203-200303，含量≥96.9%)、蒂巴因(批号:171216-200403，含量100.0%)、盐酸罂粟碱(批号:171214-200404，含量≥99.9%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。宣肺止嗽合剂10批(甘肃普安制药有限公司提供)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取吗啡0.01130 g、磷酸可待因0.01047 g，蒂巴因0.01660 g、盐酸罂粟碱0.01088 g，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇超声使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制成对照品储备液。再各取适量置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得含吗啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、蒂巴因0.3220 μg·mL-1、盐酸罂粟碱0.5217 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密量取宣肺止嗽合剂样品1 mL，用氨试液10 mL调节pH值至10～11，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，摇匀，即得。同时制得空白对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：安捷伦SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙睛-0.1%磷酸溶液(3∶97)；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。色谱图如图1所示。

(A)对照品色谱图 (B)供试品色谱图 (C)空白溶液色谱图1.蒂巴因；2.吗啡；3.盐酸罂粟碱；4.磷酸可待因 图1 HPLC 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量，加甲醇溶液配制成吗啡含量为0.849 μg·mL-1、1.698 μg·mL-1、3.395 μg·mL-1、8.489 μg·mL-1、16.977 μg·mL-1、84.886 μg·mL-1，磷酸可待因含量为0.203 μg·mL-1、0.406 μg·mL-1、0.812 μg·mL-1、2.029 μg·mL-1、4.059 μg·mL-1、20.293 μg·mL-1，蒂巴因含量为0.033 μg·mL-1、0.066 μg·mL-1、0.133 μg·mL-1、0.332 μg·mL-1、0.664 μg·mL-1、3.320 μg·mL-1，盐酸罂粟碱含量为0.052 μg·mL-1、0.104 μg·mL-1、0.209 μg·mL-1、0.522 μg·mL-1、1.043 μg·mL-1、5.217 μg·mL-16个梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分析，分别进样10 μL。按外标两点法，以峰面积为横坐标，进样量(μg·mL-1)为纵坐标，得出4种成分的回归方程、相关系数r2及线性范围，结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。见表1。

表1 4种生物碱的回归方程、线性范围和相关系数表

2.3.2 精密度试验 精密吸取浓度为吗啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、帝巴因0.3320 μg·mL-1、盐酸罂粟碱0.5217 μg·mL-1混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，测得峰面积积分值的RSD在0.22%～0.45%，表明仪器精密度良好。见表2。

表2 4种生物碱成分的精密度、重复性及稳定性结果表 (n=6)

2.3.3 重复性试验 取编号1的供试品溶液，按照“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，“2.2”项下色谱条件分析测定，分别测定并计算各成分的含量。测定结果RSD在1.35%～2.11%，表明方法重复性良好。见表2。

2.3.4 稳定性考试验 取编号1的供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样10 μL进行测定，测得各成分的含量RSD在0.56%～0.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定。见表2。

2.3.5 加样回收率试验 采用加样回收法，取已知4种生物碱含量的宣肺止嗽合剂(编号1)样品9份，分3组，取样量各为1 mL，精密加入低、中、高(0.5倍、1倍、1.5倍)3个浓度的混合对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行测定，计算回收率。详见表3。吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱的平均加样回收率分别为97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，RSD分别为1.2%、1.2%、1.6%、1.4%。

表3 加样回收率实验结果表 (n=9)

表3(续)

2.4 样品的测定 取10批次宣肺止嗽合剂，分别精密量取2 mL，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进行测定，按外标法计算样品中吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱的含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果表 (n=4)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件的优化 本方法采用加浓氨试液，在碱性条件下将生物碱盐转变成游离生物碱，用水饱和的正丁醇提取，去除脂溶性杂质，再用含5%磷酸的20%甲醇溶液提取。为了优化提取的条件,以A(供试品溶液取样量)、B(氨试液使用量)和C(水饱和正丁醇提取量)为3个因素，设计L9(34)正交试验。各因素的3水平分别为:A(1 mL、2 mL、3 mL);B(5 mL、10 mL、15 mL);C(15 mL、25 mL、35 mL)。样品液的制备:精密量取宣肺止嗽合剂样品A取样量，用氨试液提取量B调节 pH 值至10～11，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次使用量C,合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解,转移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，摇匀，即得。经微孔滤膜(0.45 μm)过滤，弃去初滤液，取续滤液进行测定分析。极差(R)结果表明,3个因素中样品量对提取率影响最大，其次是氨试液提取量，影响最小的是样品水饱和正丁醇提取量。试验表明，以宣肺止咳合剂取样量为1 mL，加入氨试液10 mL后用25 mL水饱和正丁醇提取量条件最佳，提取率最高，故确定为供试品制备方法 。

3.2 测定波长的选择 通过DAD检测器进行全波长扫描(200～400 nm)，考察了4个组分的最大紫外吸收波长，结果发现吗啡、磷酸可待因、蒂巴因都在210 nm波长处有最大吸收、盐酸罂粟碱250 nm波长处具有最大吸收，考虑可待因与蒂巴因含量较低，为获得更大灵敏度，最终确定210 nm作为检测波长，四种生物碱均有良好的响应，灵敏度较高。

3.3 流动相的优化 中国药典选用0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-0.005 moL/L庚烷磺酸钠溶液-乙腈(5∶5∶2)作为流动相，考虑到庚烷磺酸钠对色谱系统污染较大，并且样品对色谱柱的要求较高。因此通过优化方法降低了对色谱系统的污染。经查阅相关文献资料[6-10]，本实验主要考察了甲醇-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸的0.01 moL·L-1磷酸二氢钾缓冲液、乙腈-0.1%甲酸的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液4种流动相，结果表明，乙睛-0.1%磷酸溶液样品中，虽然吗啡和盐酸罂粟碱的色谱峰出峰时间较为接近，但各色谱峰的分离度均大于1.5，且各色谱峰的峰形较好，故以此流动相比例进行测定，后续实验将进一步对流动相进行优化。

3.4 结果分析 10批宣肺止嗽合剂测定结果显示，吗啡的含量为0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量为0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量为0.0002～0.0013 mg·mL-1、盐酸罂粟碱的含量为0.010～0.025 mg·mL-1，且4种成分间存在一定的变化趋势：即吗啡含量高，其他3个成分的含量也随之增加；可见《中国药典》以吗啡的含量测定对宣肺止嗽合剂质量进行控制，具有一定的意义，但不够用全面。本研究建立了高效液相色谱同时测定宣肺止嗽合剂中4种成分的含量测定方法，具有前处理简单，灵敏度高的特点，为较为全面的控制宣肺止嗽合剂质量，提供了数据支持，同时对修订完善其质量标准，保证药品有效性和安全性提供了实验基础。