高效液相色谱法测定复方半夏片中橙皮苷含量

张东霞，张火旺

（广东省河源市药品检验所，广东 河源 517000）

复方半夏片由姜半夏、麻黄、远志、桔梗、前胡、陈皮、白前、款冬花、细辛9味中药组方。方中，陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰功效，常用于治疗脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等；款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfaraL. 的干燥花蕾，具有润肺下气、止咳化痰功效，常用于治疗新旧咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血等［1］199-200，346-347。橙皮苷是陈皮和款冬花的主要有效成分，为二氢黄酮衍生物，在提高人体免疫力、抗炎、抗菌、抗病毒、保护心血管系统等方面具有重要作用［2］。《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂（第三册）》WS3-B-0581-91 中仅有鉴别项［3］，难以控制其质量。为有效控制含橙皮苷的药品质量［4-16］，本研究中建立了测定复方半夏片中橙皮苷含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CPA225D 型电子天平（赛多利斯科学仪器< 北京> 有限公司，精度为十万分之一）；DTC-15F 型超声波清洗机（湖北鼎泰生化科技设备制造有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）；UPW-20N型超纯水器（北京历元电子仪器有限公司）。

1.2 试药

橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110721-202019，纯度≥95.3%）；复方半夏片（河源市源城区誉盛大药房，批号分别为210301028，210601015，210701036）；乙腈、磷酸均为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell PAK C18柱（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：283 nm；进样量：5 µL。

2.2 溶液制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得质量浓度为0.206 6 mg/mL的对照品溶液。取样品10 片，研细，取1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方及工艺［3］制备缺陈皮和款冬花阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应吸收峰，且阴性对照无干扰。橙皮苷峰理论板数均大于6 000，分离度均大于2。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.2项下对照品溶液1，3，5，7，10 µL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标、进样量（X，µg）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 708 158.63X+10 857.02（r= 1.000，n =5）。结果表明，橙皮苷进样量在0.206 6～2.066 0 µg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2 项下对照品溶液5µL，按2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果的RSD为0.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为210301028）样品适量，共6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果橙皮苷含量的RSD为0.44%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为210301028）样品适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为0.03%（n=5），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为210301028）0.75 g，精密称定，共 6 份，置 25 mL 容量瓶中，分别加入质量浓度为1.406 0，2.812 0，4.218 0 mg/mL的对照品溶液，平行2 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取 3 批（批 号 分 别 为 210301028，210601015，210701036）样品各适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量，每批样品测3次，取平均值。结果样品中橙皮苷含量分别为3.751 3，3.165 9，3.968 2 mg/g（n=3），故暂定复方半夏片中橙皮苷定量限为3.0 mg/g。

3 讨论

3.1 提取方法选择

以甲醇为溶剂，分别对同一批（批号为210301028）样品超声提取30，45，60 min。结果超声30 min 和45 min时橙皮苷的含量较高，提取效果差异不明显。故认为在超声30 min时可基本提取完全。

3.2 流动相选择

以橙皮苷常用流动相乙腈-水溶液、甲醇-醋酸-水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液进行预试验。结果发现，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相时橙皮苷能与其他组分的色谱峰很好地分离，分离度符合要求，且峰形对称而尖锐，理论板数达到6 000 以上。故确定乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）为流动相。

3.3 检测波长选择

采用二极管阵列检测器，在190～400 nm 波长范围内对橙皮苷对照品溶液进行扫描，结果在283 nm 波长处有最大吸收，与2020 年版《中国药典（一部）》［1］199中橙皮苷的测定波长一致。故确定283 nm为检测波长。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC 法操作简便、结果准确、稳定性好，可用于复方半夏片的质量控制。