高效液相色谱指纹图谱法结合化学模式识别评价脑安胶囊整体质量

魏 培 ，曹春泉 ，朱瑞娟 ，钱 淼 ，孙新堂 △

（1. 山东畜牧兽医职业学院食品与药品科技系，山东 潍坊 261061； 2. 菏泽学院药学院，山东 菏泽 274000）

脑安胶囊是由川芎、当归、红花、人参、冰片5 味中药组方的复方制剂，具有活血化瘀、益气通络功效，用于治疗脑血栓急性期、恢复期的气虚血瘀证候，症见急性起病，半身不遂，口舌歪斜，舌强语塞，偏身麻木，气短乏力，口角流涎，手足肿胀舌黯或有瘀斑，苔薄白等［1-2］。临床用于治疗偏头痛［3］、缺血性中风气虚血瘀症［4］、高血压脑血管功能异常［5］、老年性脑梗死［6］等。脑安胶囊收载于2020 年版《中国药典（一部）》，以阿魏酸和人参皂苷Re 含量作为定量分析指标。但单一指标成分的定量分析无法完整、准确地反映中药制剂的复杂性和质量一致性。指纹图谱是采用色谱法、光谱法等分析方法得到的能体现中药整体特征的图谱，将图谱某些重要特征信息或整体信息用于中药材或中药制剂真伪鉴别或中药质量整体控制和评价的方法［7］，可科学、系统地体现中药材或中药制剂的整体性和复杂性，能较全面地反映中药材及制剂所含化学成分的相对关系，体现中药材和中药制剂的复杂性和相关性［8］，具有稳定性好、专属性强、重复性好等优点［9］，广泛应用于中药材及中药制剂的质量控制及评价［10-11］。但中药的复杂性使获取的色谱、光谱数据信息存在量大、多维的特点，具有宏观性和模糊性，增加了人工识别的难度，故需借助化学模式识别技术对指纹图谱进行数据信息的挖掘和解析。化学模式识别是一种将数理统计学、计算机信息技术与化学图谱解析整合起来，将海量、多维的原始数据通过数学算法进行压缩、降维和归类分析，找到样品集的内部规律，从而实现中药及中药制剂的分类、快速鉴别和质量控制［12］。目前，中药分析主要有监督模式识别分析和无监督模式识别分析，有监督模式识别分析常用偏最小二乘- 判别分析（PLS - DA）法、Fisher 判别等，无监督模式识别分析常用聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）等。本研究中建立了2 个生产厂家的脑安胶囊的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并结合CA 和PLS-DA 化学模式识别方法，对脑安胶囊的HPLC 指纹图谱进行统计学分析，为其质量评价提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XPR105DR/ AC 型电子天平（梅特勒- 托利多国际有限公司，精度为十万分之一）；JP - 100S 型数控超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

川芎（批号为220513，产地四川彭州市），当归（批号为220907，产地甘肃岷县），红花（批号为220402，产地新疆塔城），人参（批号为221027，产地吉林长白山），均为饮片，购自亳州市滕王药业有限责任公司；藁本内酯对照品（批号为111737-201507，含量以99.3%计），阿魏酸对照品（批号为110773-201614，含量以99.0%计），羟基红花黄色素A 对照品（批号为111637 -201609，含量以91.9%计），人参皂苷Re 对照品（批号为110754-201827，含量以93.4%计），人参皂苷Rg1对照品（批号为110703-201731，含量以99.7%计），人参皂苷Rb1对照品（批号为110704 - 201726，含量以91.1%计），山柰素对照品（批号为110861-201812，含量以93.8%计），均购自中国食品药品检定研究院；川芎嗪对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号为A0188，含量不低于98%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia 公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为娃哈哈纯净水；脑安胶囊（安徽誉隆亚乐药业有限公司，批号分别为20190414，20190529，20190913，20191107，20191122，20191205，20200311，20200427，20200608，20200630，20200904，20201016，编号为S1 - S12；上海祥鹤药业有限公司，批号分别为180714，180721，180904，181013，190714，190921，190929，编号为S13-S19）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo ScientificTMHypersil GOLDTM-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6 min 时7%A，6～25 min时 7%A → 40%A，25～45 min 时 40%A → 60%A，45～60 min时60%A，60～70 min时60%A → 90%A，70～75 min时90%A → 7%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。

2.2 溶液制备

取对照品藁本内酯、阿魏酸、川芎嗪、羟基红花黄色素A、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re 和山柰素各适量，精密称定，加70%甲醇溶解，制成藁本内酯、阿魏酸、川芎嗪、羟基红花黄色素A，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re 和山柰素质量浓度分别为26.31，33.05，17.41，22.96，24.37，28.20，30.19，24.75µg/mL的混合对照品溶液。

取样品内容物1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

分别取川芎、当归、红花、人参4味中药饮片细粉适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备单味对照药材溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取同一批（批号为20190414）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果各色谱峰相对保留时间的RSD低于 1.17%（n= 6），相对峰面积的RSD低于2.34%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20190414）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件连续进样测定，记录色谱图。结果各色谱峰相对保留时间的RSD低于0.75%（n=6），相对峰面积的RSD低于2.61%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20190414）样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，16，24，48 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果各色谱峰相对保留时间的RSD低于1.03%（n=6），相对峰面积的RSD低于3.42%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置48 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱分析

2.4.1 指纹图谱建立

将19 批（编号为S1 - S19）样品的HPLC 图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版软件，以S1号色谱图为参考图谱，设定时间窗宽度0.5，采用中位数法生成HPLC 指纹图谱和对照指纹图谱（R），详见图1。根据指纹图谱匹配结果，提取的21 个色谱峰的峰面积之和占总峰面积和的93%以上，故确定这21 个色谱峰为脑安胶囊指纹图谱的共有峰。

图1 19批脑安胶囊高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

2.4.2 共有峰归属及指认

由图2可知，1，3，4，5，6，7，8，9，10，13，14，15，19号峰归属于川芎，1，3，5，6，7，8，9，10，13，14，15，19 号峰归属于当归，1，2，3，7，8，11，12，13，21号峰归属于红花，1，3，7，16，17，18，20 号峰归属于人参。结合混合对照品溶液HPLC 图，比对指认出8个特征峰，分别为2号峰羟基红花黄色素 A、4 号峰川芎嗪、7 号峰阿魏酸、15 号峰藁本内酯、16 号峰人参皂苷Rg1、18 号峰人参皂苷Re、20号峰人参皂苷Rb1、21号峰山柰素。详见图3。

图2 脑安胶囊及各单味对照药材溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of Naoan Capsules solution and reference solution of single herb medicine

图3 混合对照品溶液高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.4.3 相似度评价

由图1可知，15号峰（藁本内酯）峰面积响应值和保留时间均符合指纹图谱参照峰要求，与相邻色谱峰分离度符合规定，故选择藁本内酯色谱峰为参照峰。相似度计算结果见表1。19 批（编号为S1-S19）样品与对照指纹图谱的相似度均不低于0.911，说明2 个生产厂家的脑安胶囊指纹图谱一致性较好。

表1 19批脑安胶囊相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation of 19 batches of Naoan Capsules

2.4.4 相对峰面积及相对保留时间计算

设置参照峰藁本内酯的峰面积和保留时间为1，计算相对其他色谱峰的峰面积及相对保留时间，结果见表2 和表3。21 个共有峰相对保留时间的RSD为0.41%～1.57%（n= 19），表明各共有峰的保留时间较稳定；相对峰面积的RSD为6.60%～40.70%（n= 19），表明各批次间共有峰峰面积差异较大，且12号峰和17号峰差异最大。

表2 19批脑安胶囊高效液相色谱指纹图谱共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

表3 19批脑安胶囊高效液相色谱指纹图谱相对峰面积Tab.3 Relative peak area of HPLC fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

2.5 化学模式分析

2.5.1 数据标准化处理

以共有峰峰面积为变量，导入SPSS 22.0 统计学软件分析，选择描述统计项下的描述对原始变量进行标准化处理，得到19×21新的标准化变量矩阵。

2.5.2 CA

将标准化变量矩阵导入SPSS 22.0 统计学软件进行CA，结果19 批脑安胶囊依生产厂家的不同聚为两类，即 S1 - S12 归为一类，S13 - S19 归为一类。详见图4。

图4 19批脑安胶囊聚类分析Fig.4 CA of 19 batches of Naoan Capsules

2.5.3 PLS-DA 模型建立及分析

将标准化变量矩阵导入Simca-P 14.1 版软件，建立 PLS-DA 模型。共提取 2 个主成分，PLS-DA 模型的3 个关键参数解释率（R2）X为 0.938 > 0.5，R2Y为1.000 > 0.5，预测力（Q2）为0.996 > 0.5，且R2X和R2Y与Q2的差距均小于0.2，表明所建模型的解释能力和预测能力均较强，可有效监督、分析19批脑安胶囊的指纹图谱信息。设置分类Y矩阵变量随机排列20 次做置换检验，R2和Q2回归线的斜率均大于1，表明所建模型可靠，不存在过度拟合现象。经PLS-DA 模型拟合分析生成散点得分图和变量投影重要性（VIP）图，详见图5和图6。

图5 PLS-DA模型散点得分图Fig.5 Scoring plot of PLS-DA

由图5 可知，19 批脑安胶囊均匀分布在95%置信区间内，S1-S12聚为一类，S13-S15聚为一类，聚类良好，区分明显，说明2 个生产厂家的脑安胶囊指纹图谱存在明显差异。VIP>1的成分对分类有显著影响，即为差异标志物。由图6 可知，脑安胶囊的差异标志物按权重大小依次为19 号峰、7 号峰（阿魏酸）、15 号峰（藁本内酯）、10 号峰、4 号峰（川芎嗪）、3 号峰、12 号峰，表明这7 个化合物对脑安胶囊指纹图谱的差异影响较大，生产时应高度重视这7个化合物，同时有必要进一步借助质谱分析等手段鉴定19号峰、10号峰、3号峰和12号峰。

图6 PLS-DA 模型的VIP图Fig.6 VIP plot of PLS-DA

3 讨论

3.1 指标成分选择

方中，川芎为君药，标志性成分为阿魏酸，同时含有酰胺类生物碱川芎嗪、苯酞类化合物藁本内酯等。研究发现，川芎嗪是一种新型钙离子拮抗剂，具有抑制自由基产生、清除自由基［13］，抑制脑缺血再灌注（I/R）损伤［14］，改善微循环、抗血小板凝集、抗炎、抗腹膜间皮细胞损伤和防治腹膜纤维化［15］，影响肿瘤细胞增殖与凋亡、侵袭与转移［16-17］等作用；藁本内酯为苯酞类化合物的主要活性物质，具有抗动脉粥样硬化、保护神经、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、镇痛等药理活性［18］，阿魏酸和藁本内酯是当归的主要活性成分；羟基红花黄色素A和山柰素是《中国药典（一部）》红花的定性指标；人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1是《中国药典（一部）》人参的定性指标，故确定本研究中的定性指标分别为阿魏酸、川芎嗪、藁本内酯、羟基红花黄色素A、山柰素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 和人参皂苷Rb18 个化合物。

3.2 色谱条件选择

本研究中采用二极管阵列检测器（DAD）于200～400 nm 波长范围内进行全波段扫描，发现HPLC 图于316 nm 波长处基线平稳，色谱峰信息丰富，峰面积响应值适中，与相邻色谱峰分离度较好，故确定检测波长为316 nm。同时，考察由甲醇、乙腈水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液组成的11 种不同流动相梯度洗脱体系对HPLC 图的影响，结果以乙腈- 0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱时，色谱峰信息更全面，峰形较好，基线平稳，故确定以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

3.3 供试品提取方法选择

本研究中考察了加热回流、浸提和超声提取3种提取方法、不同体积比甲醇水溶液、不同超声提取时间对脑安胶囊HPLC指纹图谱的影响，综合指标成分提取率、指纹图谱色谱峰信息等，最终选择2.2项下处理方法。

3.4 结果分析

由相似度结果可知，脑安胶囊化学成分一致性较好。共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.40%～1.57%和6.60%～40.70%，表明方法稳定性良好，但不同批次脑安胶囊中部分化合物含量差异较大。CA和PLS-DA将19批脑安胶囊依生产厂家的不同聚为两类，同时PLS - DA 筛选出影响分组的7 个差异标志物，分别为 19 号峰、3 号峰、10 号峰、12 号峰、阿魏酸、川芎嗪、藁本内酯。建议评价脑安胶囊稳定性时应着重关注这7个化合物的含量。

3.5 方法评价

本研究中首次采用指纹图谱结合化学模式识别技术对脑安胶囊不同生产厂家、不同生产批次的质量进行深入探索，较系统、整体、全面地分析及评价了中药复杂指纹图谱，可快速筛选脑安胶囊质量控制过程中需重点关注的指标成分。该方法科学、快速、有效，可较全面地反映脑安胶囊所含化学成分，结合相似度评价及CA 和PLS - DA 化学模式识别技术，补充了脑安胶囊现有质量评价方法的不足，为脑安胶囊HPLC 指纹图谱的分析提供了有效手段，为完善脑安胶囊的药品标准提供了试验依据。